第九章植物花藥和花粉培養(yǎng)

1、花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)：指在合成培養(yǎng)基上，改變花粉的指在合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其發(fā)育途徑，使其不形成配子不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化、最終分裂、分化、最終發(fā)育成完整植株。發(fā)育成完整植株。該發(fā)育途徑被該發(fā)育途徑被稱為稱為“花粉孢子體發(fā)育途徑花粉孢子體發(fā)育途徑”或或“雄核發(fā)育雄核發(fā)育”。 圖9-2 小麥花藥小孢子胚胎發(fā)生（引自陳耀鋒，1998） 9.1 植物花藥和花粉培養(yǎng)的概念植物花藥和花粉培養(yǎng)的概念花藥中（或花粉）小孢子的花藥中（或花粉）小孢子的雄核發(fā)育雄核發(fā)育，產(chǎn)生植物產(chǎn)生植物單倍體單倍體（haploidhaploid），進(jìn)而可以通過染色體加

2、倍），進(jìn)而可以通過染色體加倍產(chǎn)產(chǎn)生加倍單倍體生加倍單倍體（double haploiddouble haploid，DHDH）。）。雙倍體植株單倍體胚單倍體植株兩者的異同點(diǎn)兩者的異同點(diǎn)相同點(diǎn)：相同點(diǎn)： 培養(yǎng)目的相同，均獲培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。得小孢子植株。不同點(diǎn)：不同點(diǎn)： （1 1）花藥培養(yǎng)離體操）花藥培養(yǎng)離體操作技術(shù)簡(jiǎn)單，而且，藥作技術(shù)簡(jiǎn)單，而且，藥壁組織有時(shí)可作為條件壁組織有時(shí)可作為條件因子促進(jìn)小孢子的發(fā)育。因子促進(jìn)小孢子的發(fā)育。辣椒花藥辣椒花藥吊竹花粉粒吊竹花粉粒 花粉培養(yǎng)沒有藥壁組花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾；可計(jì)數(shù)小孢子織干擾；可計(jì)數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可觀察雄核發(fā)產(chǎn)胚率；可觀察雄核

3、發(fā)育的全過程；單倍體產(chǎn)育的全過程；單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復(fù)雜。量高。但技術(shù)更復(fù)雜。（2 2）花藥培養(yǎng)屬于）花藥培養(yǎng)屬于組組織培養(yǎng)織培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬；而花粉培養(yǎng)屬于于細(xì)胞培細(xì)胞培 養(yǎng)養(yǎng)。辣椒花藥辣椒花藥吊竹花粉粒吊竹花粉粒9.2.1 9.2.1 花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng) 1 1）取材）取材 鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的花蕾。宜的花蕾。 2 2）預(yù)處理）預(yù)處理 低溫（接種前低溫（接種前320320或接種后或接種后610610 ）；）；射線射線和激光；高溫預(yù)處理和激光；高溫預(yù)處理 （接種后（接種后3235 3235 ）；等方法）；等方法 9.2 9.2 花藥

4、和花粉培養(yǎng)方法花藥和花粉培養(yǎng)方法3 3）消毒）消毒 7070酒精擦洗花蕾表面，或酒精擦洗花蕾表面，或7070酒精酒精浸泡浸泡30-60s30-60s后在后在1 1次氯酸鈉溶液中浸泡次氯酸鈉溶液中浸泡10-10-20min20min或在或在0.10.1的氯化汞溶液中消毒的氯化汞溶液中消毒3-10min3-10min，無菌水沖洗無菌水沖洗3-53-5次。次。4 4）培養(yǎng)）培養(yǎng) 固體、液體與條件培養(yǎng)。固體、液體與條件培養(yǎng)。 先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚胚或或愈傷愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-32-3周）；后轉(zhuǎn)

5、入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。 圖圖9-3 9-3 小麥花藥愈傷組織（左）及芽、根的分化（右）（引自陳耀鋒，小麥花藥愈傷組織（左）及芽、根的分化（右）（引自陳耀鋒，20022002） 圖9-2 小麥花藥小孢子胚胎發(fā)生（引自陳耀鋒，1998） 與花藥組織培養(yǎng)相比，花粉培養(yǎng)具有以下與花藥組織培養(yǎng)相比，花粉培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)產(chǎn)生的植株產(chǎn)生的植株并不都是起源于花粉并不都是起源于花粉，容易受，容易受藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織的影響，再生的植藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織的影響，再生的植株中會(huì)出現(xiàn)株中會(huì)出現(xiàn)不同倍性的個(gè)體不同倍性的個(gè)體，所以花藥

6、培養(yǎng)在誘導(dǎo)，所以花藥培養(yǎng)在誘導(dǎo)單倍體方面有一定的局限性，而分離的單倍體方面有一定的局限性，而分離的花粉粒培養(yǎng)花粉粒培養(yǎng)可以克服可以克服這一不足。這一不足。由于去除了藥壁和其它連接組織的干擾，因此能更由于去除了藥壁和其它連接組織的干擾，因此能更好地好地調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)控制雄核發(fā)育的控制雄核發(fā)育的各種因子各種因子，而且能直接從，而且能直接從單細(xì)胞開始單細(xì)胞開始觀察整個(gè)雄核發(fā)育觀察整個(gè)雄核發(fā)育的過程。的過程?；ǚ凼钦嬲膯渭?xì)胞單倍體，花花粉是真正的單細(xì)胞單倍體，花粉群體的所有小孢子在培養(yǎng)條件粉群體的所有小孢子在培養(yǎng)條件下均能勻質(zhì)地接受各種化學(xué)的、下均能勻質(zhì)地接受各種化學(xué)的、物理的因子處理，是物理的因子處理，

7、是突變體篩選突變體篩選及外源基因?qū)胙芯康挠杏貌牧霞巴庠椿驅(qū)胙芯康挠杏貌牧?，?duì)育種有很大的意義。對(duì)育種有很大的意義?；ǚ刍ǚ廴后w大群體大，一個(gè)花藥中就有成，一個(gè)花藥中就有成千上萬個(gè)小孢子，從花粉培養(yǎng)能千上萬個(gè)小孢子，從花粉培養(yǎng)能得到更多的花粉植株。得到更多的花粉植株。七葉樹花粉粒1 1）自然散落法）自然散落法( (漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法) ) 將花藥接種在固體或液體培養(yǎng)基上，待花粉將花藥接種在固體或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動(dòng)散落后，收集培養(yǎng)。自動(dòng)散落后，收集培養(yǎng)。2 2）機(jī)械游離）機(jī)械游離 擠壓法擠壓法 在燒杯或研缽中用玻棒等擠壓花藥，在燒杯或研缽中用玻棒等擠壓花藥

8、， 將花粉擠出后收集培養(yǎng)。將花粉擠出后收集培養(yǎng)。磁攪拌法磁攪拌法 用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，中的花藥， 使花粉游離出來；使花粉游離出來；9.2.2.1 9.2.2.1 花粉的分離與純化花粉的分離與純化 通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。（此法應(yīng)用最廣）。 5 5）小孢子純化）小孢子純化 對(duì)上述方法獲得的小孢子混對(duì)上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級(jí)過篩、梯度離心處理純化小孢合物進(jìn)行分級(jí)過篩、梯度離心處理純化小孢子。子。 梯度離心前梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力

9、不一致）（小孢子形態(tài)、活力不一致） 30% 30%蔗糖梯度離心后蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）（獲得均一的小孢子群體）9.3.2.2 9.3.2.2 花粉培養(yǎng)方式花粉培養(yǎng)方式 平板培養(yǎng)平板培養(yǎng) 花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。液體培養(yǎng)液體培養(yǎng) 花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。震蕩，以利通氣。雙層培養(yǎng)雙層培養(yǎng) 花粉置固體花粉置固體- -液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)

10、基。預(yù)培養(yǎng)法預(yù)培養(yǎng)法 將花藥在培養(yǎng)基上先培養(yǎng)將花藥在培養(yǎng)基上先培養(yǎng)3 34 d4 d，再，再將花粉分離出來小三角瓶中作薄層培養(yǎng)。將花粉分離出來小三角瓶中作薄層培養(yǎng)。微室培養(yǎng)微室培養(yǎng) 利用小的蓋玻片和凹穴載玻片利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng) 利用培養(yǎng)過花藥的液體利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等?？醋o(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng) 利用花藥或花藥愈傷組織釋放利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。出的活性物

11、質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育?？醋o(hù)培養(yǎng)圖解看護(hù)培養(yǎng)圖解9.4 9.4 花藥培養(yǎng)一步成苗花藥培養(yǎng)一步成苗通?；ㄋ幣囵B(yǎng)一般是采用脫分化、再分化和生根通常花藥培養(yǎng)一般是采用脫分化、再分化和生根壯苗等幾個(gè)培養(yǎng)程序，稱為壯苗等幾個(gè)培養(yǎng)程序，稱為多級(jí)成苗。多級(jí)成苗。一次成苗又稱一步成苗或一次成苗又稱一步成苗或直接成苗，直接成苗，是指離體培是指離體培養(yǎng)的花藥組織的花粉細(xì)胞養(yǎng)的花藥組織的花粉細(xì)胞在一種培養(yǎng)基上同時(shí)完在一種培養(yǎng)基上同時(shí)完成脫分化和再分化過程成脫分化和再分化過程，直接分化出完整植株的，直接分化出完整植株的培養(yǎng)方法。培養(yǎng)方法。 圖9-4 小麥花藥培養(yǎng)一步成苗與多級(jí)成苗相比，一步成苗有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：與多級(jí)成苗

12、相比，一步成苗有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1 1） 一步成苗簡(jiǎn)化了培養(yǎng)程序，降低了培養(yǎng)成本，加一步成苗簡(jiǎn)化了培養(yǎng)程序，降低了培養(yǎng)成本，加快了成苗速度。快了成苗速度。2 2）一步成苗提高了花藥培養(yǎng)效率。（提高綠苗率，一步成苗提高了花藥培養(yǎng)效率。（提高綠苗率，主要通過胚狀體成苗）主要通過胚狀體成苗）3 3）一步成苗中綠苗的質(zhì)量明顯提高。（生長(zhǎng)快而健一步成苗中綠苗的質(zhì)量明顯提高。（生長(zhǎng)快而健壯）壯）4 4）一步成苗簡(jiǎn)化了培養(yǎng)過程，減少了愈傷組織形成一步成苗簡(jiǎn)化了培養(yǎng)過程，減少了愈傷組織形成過程中的細(xì)胞變異，有效降低了白化苗產(chǎn)生頻率。過程中的細(xì)胞變異，有效降低了白化苗產(chǎn)生頻率。白化苗的重要特性白化苗的重要特性:

13、:生殖生長(zhǎng)和雌蕊的發(fā)育均不正常，不能完成有生殖生長(zhǎng)和雌蕊的發(fā)育均不正常，不能完成有性世代和獲得白化苗的種子，無法用這種方法性世代和獲得白化苗的種子，無法用這種方法證明它是否是一種可遺傳性狀。證明它是否是一種可遺傳性狀。在花粉白化苗的細(xì)胞中，常發(fā)現(xiàn)有微核存在。在花粉白化苗的細(xì)胞中，常發(fā)現(xiàn)有微核存在。9.5 9.5 白化苗現(xiàn)象白化苗現(xiàn)象白化苗葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，無正常發(fā)育的白化苗葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，無正常發(fā)育的成熟葉綠體，只存在前質(zhì)體到近乎正常葉綠成熟葉綠體，只存在前質(zhì)體到近乎正常葉綠體的各種形態(tài)的質(zhì)體。體的各種形態(tài)的質(zhì)體?；ǚ郯谆绾途G苗在蛋白質(zhì)、花粉白化苗和綠苗在蛋白質(zhì)、RNARNA和和DNA

14、DNA的的組成上有明顯差異。組成上有明顯差異?；ǚ壑仓甑陌谆F(xiàn)象是不可逆的，通過改變花粉植株的白化現(xiàn)象是不可逆的，通過改變營(yíng)養(yǎng)成分或其它條件都無法使白苗轉(zhuǎn)綠。營(yíng)養(yǎng)成分或其它條件都無法使白苗轉(zhuǎn)綠。9.5.1 9.5.1 白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理1 1）內(nèi)因）內(nèi)因 供體植株基因型（如秈稻比粳稻供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時(shí)期。白苗率高）、花粉發(fā)育時(shí)期。2 2）外因）外因 預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時(shí)與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時(shí)間等。間等。3 3）機(jī)理）機(jī)理 核基因起關(guān)鍵作

15、用，導(dǎo)致質(zhì)體核基因起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致質(zhì)體DNADNA缺失，產(chǎn)生白苗。另外無性系變異也可能缺失，產(chǎn)生白苗。另外無性系變異也可能是原因之一。是原因之一。9.5.2 9.5.2 白化苗的控制白化苗的控制通過對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分通過對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進(jìn)行調(diào)控。等因素進(jìn)行調(diào)控。1)1)胚狀體發(fā)育途徑胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個(gè)階段，最后子葉展開，形成花粉植株。的各個(gè)階段，最后子葉展開，形成花粉植株。9.6 9.6 花粉植株形態(tài)發(fā)生方式花粉植株形態(tài)發(fā)生方式a) a) 球形胚球形胚 d) d) 魚雷形胚魚雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)蕓苔屬小孢子培養(yǎng)煙草花

16、藥培養(yǎng)煙草部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)通過胚狀體途徑再生形成小植株煙草花藥培養(yǎng)通過胚狀體途徑再生形成小植株2)2)愈傷組織發(fā)育愈傷組織發(fā)育途徑途徑 小孢子小孢子分裂數(shù)次形成愈分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成傷，再分化形成花粉植株。此途花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會(huì)徑產(chǎn)生的植株會(huì)出現(xiàn)變異且倍性出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。復(fù)雜。水水稻稻花花藥藥培培養(yǎng)養(yǎng)愈傷組織轉(zhuǎn)接種愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形愈傷組織分化形成再生植株成再生植株接種在平板上的水稻花藥接種在平板上的水稻花藥部分花藥產(chǎn)生愈傷組織部分花藥產(chǎn)生愈傷組織9.7.1 9.7.1 倍性

17、鑒定倍性鑒定(1)(1)染色體直接計(jì)數(shù)法染色體直接計(jì)數(shù)法 通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。(2)(2)間接鑒定間接鑒定 掃描細(xì)胞光度儀鑒定（流式細(xì)胞儀）掃描細(xì)胞光度儀鑒定（流式細(xì)胞儀） 主要測(cè)定葉片單個(gè)細(xì)胞中主要測(cè)定葉片單個(gè)細(xì)胞中DNADNA的含量確定的含量確定細(xì)胞的倍性，材料的使用量可少到細(xì)胞的倍性，材料的使用量可少到1cm21cm2。9.7 9.7 單倍體植株鑒定和染色體加倍單倍體植株鑒定和染色體加倍 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法 葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上的氣孔葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及

18、保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。具有高度的相關(guān)性。 植株形態(tài)學(xué)鑒定法植株形態(tài)學(xué)鑒定法 單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長(zhǎng)，單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長(zhǎng)，花粉粒小，不結(jié)實(shí)?；ǚ哿Ｐ。唤Y(jié)實(shí)。雜交鑒定法雜交鑒定法 自交或測(cè)交鑒定，看后代分離情況確定二自交或測(cè)交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細(xì)胞。倍體植株是來自小孢子還是體細(xì)胞。分子標(biāo)記鑒定分子標(biāo)記鑒定 包括生化標(biāo)記（如同工酶標(biāo)記）和分子包括生化標(biāo)記（如同工酶標(biāo)記）和分子標(biāo)記（如標(biāo)記（如RFLPRFLP、RAPDRAPD、AFLPAFLP等）等）9.7.2 9.

19、7.2 單倍體植株的單倍體植株的染色體加倍染色體加倍浸入法浸入法即在花粉苗移前、后用秋水仙素等化學(xué)試劑即在花粉苗移前、后用秋水仙素等化學(xué)試劑進(jìn)行浸泡根、莖、生長(zhǎng)點(diǎn)或分蘗節(jié)進(jìn)行染色進(jìn)行浸泡根、莖、生長(zhǎng)點(diǎn)或分蘗節(jié)進(jìn)行染色體加倍的方法。體加倍的方法。對(duì)于健壯的植株應(yīng)采用簡(jiǎn)易的浸根法對(duì)于健壯的植株應(yīng)采用簡(jiǎn)易的浸根法 ，對(duì)生，對(duì)生長(zhǎng)較弱的植株適宜于用先移栽后加倍處理的長(zhǎng)較弱的植株適宜于用先移栽后加倍處理的刨根法。刨根法。培養(yǎng)過程加倍法培養(yǎng)過程加倍法脫分化期培養(yǎng)基中加入低濃度秋水仙素加倍，脫分化期培養(yǎng)基中加入低濃度秋水仙素加倍，加倍效果都不很理想加倍效果都不很理想在繼代培養(yǎng)基中加入秋水仙素是加倍處理另在繼

20、代培養(yǎng)基中加入秋水仙素是加倍處理另一途徑。一途徑。注射法注射法 禾谷類作物花培單倍體苗采用分蘗節(jié)注射法可以禾谷類作物花培單倍體苗采用分蘗節(jié)注射法可以得到良好的加倍效果。小麥單倍體苗在分蘗前用得到良好的加倍效果。小麥單倍體苗在分蘗前用0.05% 0.05% 的秋水仙素的秋水仙素+1.5% +1.5% 的二甲基亞砜注射分蘗節(jié)，的二甲基亞砜注射分蘗節(jié)，注射在清晨注射在清晨8 81010時(shí)進(jìn)行，共三次，每隔一天注射一時(shí)進(jìn)行，共三次，每隔一天注射一次，每次用量次，每次用量25 L25 L，這一加倍方法的加倍成功率可，這一加倍方法的加倍成功率可達(dá)到達(dá)到40%40%以上，最高可達(dá)以上，最高可達(dá)6868。生長(zhǎng)

21、錐處理法生長(zhǎng)錐處理法雙子葉植物多用此種加倍方法，可用涂布、滴下、雙子葉植物多用此種加倍方法，可用涂布、滴下、帶藥棉球處理法進(jìn)行加倍。帶藥棉球處理法進(jìn)行加倍。9.7.2 染色體加倍 （為什么要進(jìn)行加倍？）9.7.2.1 9.7.2.1 莖段培養(yǎng)莖段培養(yǎng) 將單倍體植株的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷將單倍體植株的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會(huì)有一定頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍會(huì)有一定頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細(xì)胞，分化出純合的二倍體植株。體細(xì)胞，分化出純合的二倍體植株。有秋水仙素、有秋水仙素、OryzalinOryzal

22、in、trifluralintrifluralin、APMAPM等。等。1) 1) 無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株、根、莖、生長(zhǎng)點(diǎn)或分蘗節(jié)進(jìn)行染色體加小植株、根、莖、生長(zhǎng)點(diǎn)或分蘗節(jié)進(jìn)行染色體加倍的方法。倍的方法。 雙子葉植物多用此種加倍方法，可用涂布、滴雙子葉植物多用此種加倍方法，可用涂布、滴下、帶藥棉球處理（頂芽或腋芽）法進(jìn)行加倍。下、帶藥棉球處理（頂芽或腋芽）法進(jìn)行加倍。9.7.2.2 9.7.2.2 化學(xué)試劑誘變化學(xué)試劑誘變（3 3）培養(yǎng)過程加倍法）培養(yǎng)過程加倍法脫分化期培養(yǎng)基中加入低濃度秋水仙素加倍，脫分化期培養(yǎng)基中加入低濃度秋水仙素

23、加倍，加倍效果都不很理想加倍效果都不很理想在繼代培養(yǎng)基中加入秋水仙素是加倍處理另在繼代培養(yǎng)基中加入秋水仙素是加倍處理另一途徑。一途徑。（4 4）注射法）注射法 禾谷類作物花培單倍體苗采用分蘗節(jié)注射禾谷類作物花培單倍體苗采用分蘗節(jié)注射法可以得到良好的加倍效果。這一加倍方法法可以得到良好的加倍效果。這一加倍方法的加倍成功率可達(dá)到的加倍成功率可達(dá)到40%40%以上，最高可達(dá)以上，最高可達(dá)6868。 （毒性小，引起植株的變異幾率?。ǘ拘孕?，引起植株的變異幾率?。┗ㄋ幒突ǚ叟囵B(yǎng)基本流程：預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子收集具胚性小孢子

24、的花藥，或離心收集胚性小孢子培養(yǎng)（充足的營(yíng)養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體培養(yǎng)（充足的營(yíng)養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)萌發(fā)”形成小植株。形成小植株。選擇合適的供體植株（選擇合適的供體植株（F1F1？）？）倍性鑒定或染色體加倍倍性鑒定或染色體加倍9.2 9.2 花藥或花粉培養(yǎng)的意義：花藥或花粉培養(yǎng)的意義：供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系9.2.1 9.2.1 作物育種作物育種（1 1）縮短育種周期：縮短育種周期：常規(guī)育種需常規(guī)育種需4-64-6年獲得純年獲得純系，而

25、小系，而小 孢子培養(yǎng)僅需一年。孢子培養(yǎng)僅需一年。例子：例子：二倍體供體植株基因型為二倍體供體植株基因型為AaBbAaBb，若要從后代，若要從后代中選擇基因?yàn)橹羞x擇基因?yàn)锳AbbAAbb的純合單株的純合單株常規(guī)方法常規(guī)方法： AAbbAAbb出現(xiàn)的概率為出現(xiàn)的概率為1/161/16，并且不，并且不能將能將AAbbAAbb與與AabbAabb、aAbbaAbb區(qū)分開。區(qū)分開。ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb二倍體供體植株基因型為二倍體供體植株基因型為AaBbAaBb，若要

26、從后代，若要從后代中選擇基因?yàn)橹羞x擇基因?yàn)锳AbbAAbb的純合單株的純合單株單倍體方法單倍體方法： AAbbAAbb出現(xiàn)的概率為出現(xiàn)的概率為1/41/4。 單倍體單倍體 二倍體二倍體AB- - - - AABBaB- - aaBBAb- - AAbbab- - aabb供體親本供體親本AaBbAaBb花培花培誘變育種中的作用誘變育種中的作用 植株不受顯隱性的影植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代及時(shí)獲得突變個(gè)體，響，在誘變育種中能在當(dāng)代及時(shí)獲得突變個(gè)體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。加倍后成為穩(wěn)定的純系。9.2.2 9.2.2 物種進(jìn)化研究物種進(jìn)化研究 可探索親本染色體組可探索親本染色體組的構(gòu)

27、成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時(shí)，形成二的構(gòu)成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時(shí)，形成二價(jià)體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存價(jià)體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。在同源染色體。 9.2.3 9.2.3 遺傳分析遺傳分析 單倍體植株中基因不受顯單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個(gè)基因的作用均能表現(xiàn)出來。隱性的影響，每一個(gè)基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基能用來研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析。因的劑量效應(yīng)分析。9.2.4 9.2.4 構(gòu)建連鎖圖譜構(gòu)建連鎖圖譜 雙單倍體（雙單倍體（DHDH）群體）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)

28、建。是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)建。9.2.5 9.2.5 用于遺傳轉(zhuǎn)化用于遺傳轉(zhuǎn)化 能直接表達(dá)外源基因，能直接表達(dá)外源基因，不受顯隱性影響。不受顯隱性影響。9.8 9.8 花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用（1 1）植物單倍體育種）植物單倍體育種花粉單倍體育種只需花粉單倍體育種只需兩個(gè)世代兩個(gè)世代就可以得到穩(wěn)就可以得到穩(wěn)定的品系，而常規(guī)雜交育種通常需要經(jīng)過定的品系，而常規(guī)雜交育種通常需要經(jīng)過5 57 7代代自交分離和選擇，才能逐步獲得穩(wěn)定的選自交分離和選擇，才能逐步獲得穩(wěn)定的選擇材料。擇材料。（2） 構(gòu)建構(gòu)建DH群體群體 n利用花培和單倍體的加倍，利用花培和單倍體的加倍，創(chuàng)建的純合雙單倍體創(chuàng)建的純合雙單倍體（double Haploiddouble Haploid，DHDH）系是一個(gè)重要的遺傳分）系是一個(gè)重要的遺傳分析群體，析群體，廣泛應(yīng)用于抗病、抗蟲、抗旱等性狀的廣泛應(yīng)用于抗病、抗蟲、抗旱等性狀的篩選、分子標(biāo)記等基礎(chǔ)研究以及遺傳圖譜構(gòu)建、篩選、分子標(biāo)記等基礎(chǔ)研究以及遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等遺傳研究?；蚨ㄎ坏冗z傳研究。 圖9-11 小麥單倍體無性系（左）及抗性系的再生（右）