細(xì)胞凍存與細(xì)胞復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP).

1、背景知識(shí) ：細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過(guò)程中，在培養(yǎng)器具、 培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的耗費(fèi)，而且細(xì)胞一旦離開(kāi)活體開(kāi)始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要。細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在 -70冰箱中可以保存一年之久；細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的。原理 ：細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成， 從而減少由于冰晶

2、形成造成的細(xì)胞損傷。 復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。主體內(nèi)容（操作步驟） ：一、材料（一）儀器1. 凈化工作臺(tái)2. 離心機(jī)3. 恒溫水浴箱4. 冰箱（ 4、 -20、 -70）5. 倒置相差顯微鏡6. 培養(yǎng)箱7. 液氮冰箱易生物儀器庫(kù)： （二）玻璃器皿1. 吸管（彎頭、直頭）2. 培養(yǎng)瓶3. 玻璃瓶（ 250ml 、 100ml ）4. 廢液缸（三）塑料器皿1. 吸頭2. 槍頭3. 膠塞4. 移液管（ 10ml）5. 15ml 離心管6. 凍存管（ 1 2ml ）（四）其他物品1. 微量加

3、樣槍2. 紅血球計(jì)數(shù)板3. 記號(hào)筆4. 醫(yī)用橡皮膏5. 移液槍（五）試劑1. D-Hanks 液2. 小牛血清3. 培養(yǎng)液4. 雙抗（青霉素、鏈霉素）5. 胰蛋白酶（ 0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO （分析純）或無(wú)色新鮮甘油易生物試劑庫(kù)： 二、操作步驟（一）細(xì)胞凍存1. 配制含 10%DMSO 或甘油、 1020%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至 15ml 離心管中、；3. 離心 1000rpm ， 5min；4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管

4、輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5× 106/ml 1× 107 /ml ；5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1 1.5 ml ；6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者；7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1 -2 / min ；當(dāng)溫度達(dá) -25以下時(shí)，可增至-5 -10 /min ；到 -100時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20 冰箱 2h ，然后放入（二）-70冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。細(xì)胞復(fù)蘇1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。2. 從 37水浴中取出凍存管，打開(kāi)

5、蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10 倍以上培養(yǎng)液，混勻；3. 離心， 1000rpm， 5min ；4. 棄去上清液，加入含 10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶， 37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。三、注意事項(xiàng)1從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液；2將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷；3凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。四、細(xì)胞復(fù)蘇在細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程中， 有多次復(fù)蘇失敗， 最終在查閱了相關(guān)技術(shù)積累了足夠的復(fù)蘇技能后復(fù)蘇成功，現(xiàn)將細(xì)胞復(fù)蘇的操作

6、程序和注意事項(xiàng)總結(jié)如下，望能為同行提供些參考?！静牧稀?.常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)儀器設(shè)備、恒溫水浴振蕩器。2.培養(yǎng)液（ DMEM ）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO ）?！静僮鞒绦颉?.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，紫外照射40min 以上。2.培養(yǎng)液（ DMEM ）、 0.25胰蛋白酶（ Trypsin ）恒溫水浴箱370C 預(yù)熱 20min ，備用。3.二甲基亞砜（DMSO) 在 4 度冰箱中冷藏30min ，備用。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入5.將細(xì)胞懸液移入15ml 離心管，緩慢加入40 度水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。4ml 培養(yǎng)液，離心（1000r/min ， 5min）。

7、6.用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.記錄復(fù)蘇日期?！咀⒁馐马?xiàng)】1.取細(xì)胞的過(guò)程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。 此項(xiàng)尤為重要， 細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。2.凍存液的問(wèn)題：凍存液的配置已是常識(shí)，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO ）對(duì)細(xì)胞不是完全無(wú)毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作較大，因此，必須在 1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO ）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷

8、。4. 離心問(wèn)題：目前主要有兩種見(jiàn)解。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液。因?yàn)殡x心的目的是兩個(gè)，去除DMSO ，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程， 但對(duì)一般人來(lái)說(shuō)，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過(guò)了活細(xì)胞會(huì)受壓過(guò)大，死亡。此外在操作過(guò)程中容易污染，所以不推薦。另一種說(shuō)法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO ）， DMSO 對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。 我在試驗(yàn)中按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇，結(jié)果無(wú)異常。5. 細(xì)胞貼壁少的問(wèn)題：教科書(shū)中說(shuō)明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml 細(xì)胞液要加 10ml 15m培養(yǎng)液，而在我的試驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。6. 復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問(wèn)題：試驗(yàn)中我的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為復(fù)蘇1 管細(xì)胞一般可分裝到1-2 只培養(yǎng)瓶中，分裝過(guò)多，細(xì)胞濃度過(guò)低，不利于細(xì)胞的貼壁。7. 加培養(yǎng)基的量放入問(wèn)題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問(wèn)題是DMSO的濃度，從如