細胞培養(yǎng)基質(zhì)量標準及檢驗方法

1、細胞培養(yǎng)基質(zhì)量標準及檢驗方法中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會二 0 一一年四月編寫說明一、根據(jù)中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會2010 年 9 月 20 日 組織召開的動物細胞培養(yǎng)基生產(chǎn)管理及質(zhì)量控制學術(shù)研討會紀要，結(jié)合我國的實際情況制定本標準。二、本標準以中國藥典2010 版和哺乳類動物細胞培養(yǎng)基 （HG/T 3935-2007）行業(yè)標準為依據(jù)，結(jié)合生物制品對細胞培養(yǎng)基原材料的特殊要求制定，增加了牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量等檢測項目。三、本標準分為細胞培養(yǎng)基檢驗項目和每個項目的檢驗方法兩部分，為評判細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品質(zhì)量提供了依據(jù)和方法，從而規(guī)范我國細胞培養(yǎng)基行業(yè)健康發(fā)展。四、結(jié)果評定依據(jù)本標準和方法對細胞培養(yǎng)基

2、樣品進行全項檢驗，所有項目均符合標準要求， 判定該樣品為合格；若有一項不符合標準要求，則判定樣品為不合格。2細胞培養(yǎng)基質(zhì)量標準及檢驗方法一、 細胞培養(yǎng)基質(zhì)量標準細胞培養(yǎng)基質(zhì)量應(yīng)符合表1 所示的技術(shù)要求。表 1技術(shù)要求檢驗項目限度要求澄清度澄清pH 值（每升標示量 /L ）pH 允許偏差范圍為± 0.302滲透壓允許偏差范圍為±5滲透壓（ mOsm/kgHO）干燥減量的質(zhì)量分數(shù)（ %） 5.0細菌內(nèi)毒素（ EU/ml） 10細菌數(shù) 200（ CFU/g）微生物限度霉菌數(shù) 50（ CFU/g）細胞形態(tài)成纖維樣貼壁生長， 形態(tài)正常無變異細胞生長試驗培養(yǎng) 72h細胞數(shù)量不低于1&#

3、215;（vero 細胞）5；繼續(xù)維持 48h 細細胞數(shù)量10 cells/ml胞數(shù)量不低于 1× 105cells/ml牛血清白蛋白不得檢出抗生素不得檢出檢驗方法中華人民共和國藥典 2010 年版二部附錄 B 進行。中華人民共和國藥典 2010 年版附錄 H 進行。中華人民共和國藥典 2010 年版二部附錄 G 滲透壓摩爾濃度測定法進行。按中華人民共和國藥典 2010 年版二部附錄 L 干燥失重測定法進行。按中華人民共和國藥典 2010 年版附錄 E 細菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進行。按中華人民共和國藥典 2010 年版附錄 J 微生物限度檢查法進行，檢查項目為細菌數(shù)、霉菌數(shù)。 檢查

4、法采用平皿法。按中華人民共和國化工行業(yè)標準哺乳類動物細胞培養(yǎng)基 HG/T 3935-2007 第 7.7 條進行。依據(jù)中華人民共和國藥典 2010 年三部附錄 I 牛血清白蛋白殘留量測定法進行， 不得檢出牛血清白蛋白。依據(jù)中華人民共和國藥典 2010 年三部附錄 A 抗生素殘留量測定法進行， 不得檢出青霉素、鏈霉素及慶大霉素。二、 檢驗方法除非另有說明，檢驗中僅使用確認為分析純的試劑和中華人民共和國藥典2010年版中規(guī)定的純化水。2.1 澄清度的測定稱取每升標示量的實驗室樣品，置于 1 000ml 燒杯中， 加水 950ml，攪拌至溶解， 補加水至 1000ml,攪拌均勻。按中華人民共和國藥典

5、2010 年版二部附錄 B 進行。32.2pH值的測定稱取每升標示量的實驗室樣品，置于 1 000ml 燒杯中， 加水 950ml ，攪拌至溶解， 補加水至 1000ml,攪拌均勻。按中華人民共和國藥典2010 年版三部附錄 A 進行。2.3干燥減量的測定按中華人民共和國藥典2010 年版三部附錄 L 干燥失重測定法進行。2.4滲透壓的測定稱取每升標示量的實驗室樣品，置于 1 000ml 燒杯中， 加水 950ml ，攪拌至溶解， 補加水至 1000ml,攪拌均勻。按中華人民共和國藥典2010 年版三部附錄 H滲透壓摩爾濃度測定法進行。取兩次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為測定結(jié)果，兩次平行測定結(jié)果

6、的絕對差值不大于這兩個測定值的算術(shù)平均值的 5%。2.5細菌內(nèi)毒素的測定按中華人民共和國藥典2010 年版三部附錄 E 細菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進行。2.6微生物限度的測定按中華人民共和國藥典2010年三部附錄 G微生物限度檢查法進行，檢查項目為細菌數(shù)、霉菌數(shù)。檢查法采用平皿法。2.7細胞生長試驗2.7.1貼壁型細胞生長試驗2.7.1.1方法提要1) 本試驗所用容器具及溶液均為無菌，試驗操作過程均為無菌操作。2)細胞在 37恒溫條件下，在含體積分數(shù)3%或 10%的小牛血清的細胞培養(yǎng)液中生長72h，觀察細胞形態(tài)并進行細胞計數(shù)；細胞生長72h 后，更換不含小牛血清的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀

7、察細胞形態(tài)并進行細胞計數(shù)。2.7.1.2試劑和材料1)牛血清：符合中華人民共和國藥典2010年版三部附錄 D。2)平衡鹽溶液： 稱取氯化鉀0.2g ，精確至 0.01g ；無水磷酸二氫鉀 0.2g，精確至 0.01g ；氯化鈉 8.0g ，精確至0.01g ；無水磷酸氫二鈉1.15g ，精確至0.001g ；加純化水 1 000ml，混勻，測pH 值， pH 值應(yīng)在7.5 ± 0.3 ，過濾除菌即得。3) 細胞： vero 細胞（或根據(jù)不同的細胞培養(yǎng)基種類選擇適應(yīng)的細胞): 細胞代次不超過150 代。4) 細胞培養(yǎng)液：按產(chǎn)品使用說明書要求配制；3) 胰蛋白酶溶液：稱取胰蛋白酶（1:2

8、50 ） 2.5g ，精確至 0.01g ，加 1 000ml 平衡鹽溶液，混勻、測pH 值，用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl調(diào) pH 值 7.6 7.8 ，過濾除菌即得。42.7.1.3儀器1）醫(yī)用凈化工作臺：潔凈級別為百級.2）二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱： 能通二氧化碳氣體并且保持二氧化碳體積分數(shù)為（5±0.1 ），能在（37±1）恒溫。3）細胞培養(yǎng)瓶：T25 型、無菌。4）顯微鏡：倒置、相差。5）血球計數(shù)板。6）蓋玻片：無水乙醇浸泡并擦干。2.7.1.4試驗步驟1）制備細胞懸液A 取長成致密單層的細胞種子，將原細胞培養(yǎng)液從細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)吸出，用適量平衡鹽溶液

9、洗細胞一次，棄洗液（去除死細胞） 。B 向細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶溶液1ml ，消化一定時間，在顯微鏡下觀察, 當細胞變圓接近脫壁時，將胰蛋白酶溶液倒掉。C 根據(jù)細胞數(shù)量加入一定量細胞培養(yǎng)液，用吸管吹打，使細胞脫壁制成細胞懸液A。2) 細胞培養(yǎng)A 吸取一定量的細胞懸液A，加到細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。B 向細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加至10ml 含體積分數(shù)為3%或 10%的小牛血清的細胞培養(yǎng)液，使細胞接種數(shù)量為5× 104 細胞 /ml 。C 將細胞培養(yǎng)瓶送入培養(yǎng)箱，在（37±1）溫度條件及（ 5±0.1 ）二氧化碳條件下進行培養(yǎng)。D 培養(yǎng) 72h，觀察細胞形態(tài)，按照2.7.1.4步驟 1

10、）方法制備細胞懸液，進行活細胞計數(shù)。E培養(yǎng) 72h后，更換不含牛血清的細胞培養(yǎng)液10ml，繼續(xù)培養(yǎng) 48h，觀察細胞形態(tài)，按照2.7.1.4試驗步驟 1）方法制備細胞懸液，進行活細胞計數(shù)。3)細胞計數(shù)A 將需要計數(shù)的細胞按按照2.7.1.4步驟 1）方法制備細胞懸液B。B 吸取細胞懸液 B100 l 轉(zhuǎn)移至離心管中，視細胞量確定是否稀釋及稀釋倍數(shù)。C 將蓋玻片蓋于計數(shù)板中心的計數(shù)室上方。調(diào)整計數(shù)板中的細胞數(shù)量在（100 300）個。沿蓋玻片邊緣點加細胞懸液使其通過毛細作用自然滲入，不要留有氣泡，不要外溢，顯微鏡下計數(shù)。D 觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)，細胞壓中線時，一般遵循“計左不計右，計上

11、不計下”的原則。將計數(shù)板觀察細胞數(shù)代入下列公式：計數(shù)板觀察細胞數(shù)× 10 4 ×稀釋倍數(shù) /4 細胞數(shù) /ml52.7.1.5分析結(jié)果的表述培養(yǎng) 72h的細胞， 細胞形態(tài)應(yīng)正常，活細胞數(shù)量應(yīng)達到1× 105個 /ml 以上。 繼續(xù)維持培養(yǎng) 48h的細胞形態(tài)應(yīng)正常，活細胞數(shù)量應(yīng)不小于1× 105個 /ml 以上。2.7.2懸浮型細胞生長試驗2.7.2.1方法提要本試驗所用容器具及溶液均為無菌，試驗操作過程均為無菌操作。細胞在 37恒溫條件下，在細胞培養(yǎng)液中懸浮生長72h，觀察細胞形態(tài)，進行72h細胞計數(shù)。2.7.2.2試劑和材料1）細胞：已適應(yīng)待檢細胞培養(yǎng)

12、基的懸浮細胞株。2）細胞培養(yǎng)液：按產(chǎn)品使用說明書要求配制；2.7.2.3儀器1） 醫(yī)用凈化工作臺：潔凈級別為百級；2） 恒溫震蕩培養(yǎng)箱：能在（37± 1）恒溫；3） 細胞培養(yǎng)瓶： 250ml 搖瓶，應(yīng)無菌；4） 顯微鏡：倒置、相差；2.7.2.4細胞培養(yǎng)1）用方瓶或搖瓶擴增細胞；2）離心細胞，用待測細胞培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，計算出所需要的細胞數(shù)；3）將細胞轉(zhuǎn)至搖瓶中，細胞數(shù)量接種數(shù)量為2.5 × 105個 /ml ，加液量 20ml左右；4）將搖瓶細胞移至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速90 100rpm，溫度 37；5）培養(yǎng) 72h，記錄細胞數(shù)量和活率（采用0.4%的臺盼藍染色法計數(shù)及計算活率）。2.7.2.5細胞活率計算1） 細胞染色：取吸管1支，伸入培養(yǎng)瓶中，輕輕反復(fù)吹打細胞懸液使細胞重懸均勻后，立即吸細胞懸液少許，向另一離心管中滴入細胞懸液1份，再滴入臺盼藍染液1份，混勻，置 2 3分鐘。2） 計數(shù)：按 2.7.1.4步驟 1 ）進行。鏡下觀察可見細胞分散各處，健康細胞胞體完整，透明不著色，凡著色細胞均為死細胞。記錄活細胞數(shù)及細胞總數(shù)。3）活率計算細胞活率 % =（活細胞數(shù)量/ 細胞總數(shù)）× 100%2