聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR實(shí)驗(yàn)報告

1、；實(shí)驗(yàn)二聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）一、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）是利用 DNA片段旁側(cè)兩個短的單鏈引物，在體外快速擴(kuò)增特異 DNA片段的技術(shù)。它應(yīng)用熱穩(wěn)定的聚合酶，通過雙鏈 DNA模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復(fù)循環(huán)， DNA片段以指數(shù)方式增加了百萬倍。從非常微量的 DNA甚至單個細(xì)胞所含有的 DNA起始，可產(chǎn)生 ug 量的 PCR產(chǎn)物。二、器材與試劑1. 器材：移液器， EP 管，熱蓋 PCR儀，電泳儀，量筒，錐形瓶，微波爐，電子天平，紫外照色儀2. 試劑：引物，模板，Taq DNA聚合酶，原料（dNTPs），緩沖液與 Mg2+，H2O, 2*PCRmix溶液， DNA染料三、實(shí)

2、驗(yàn)步驟PCR反應(yīng)體系的建立取離心管，依次加入試劑混勻1H2O12l2模板1l3引物 T71 l4引物 sp61l52*PCRmix15 lPCR儀的熱循環(huán)反應(yīng)把離心管放入 PCR儀中，由變性 - 退火 - 延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成1. 模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至 94左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；2. 模板 DNA與引物的退火 ( 復(fù)性 ) ：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 56 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；3. 引物的延伸：經(jīng)加熱至 72左右 DNA模板

3、- 引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料， 靶序列為模板， 按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)該循環(huán) 30 次，每次需要 2-3 分鐘。電泳檢測結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中， 電泳結(jié)束后， 放到紫外照射儀中進(jìn)行透射， 電泳明膠顯示清晰的條帶，如下圖所示 加入的為 1 號樣，出現(xiàn)在 500bp 左右條帶，而預(yù)算結(jié)果為擴(kuò)增出 492bp 條帶，故實(shí)驗(yàn)成功。.；四、討論1. Mg2+離子濃度對 PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低 PCR擴(kuò)增的特 異性濃度過低則影響 PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使 PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

4、2. 變性溫度低， 變性時間短， 極有可能出現(xiàn)假陰性 ; 退火溫度過低， 可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。3. EB：溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖中的 DNA，可與 DNA結(jié)合，用標(biāo)準(zhǔn) 302nm 紫外光透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號。4. 溴酚藍(lán)：電泳指示劑，相當(dāng)于 300bp 的 DNA的電泳速度。5.100bp DNA Marker是由單獨(dú)的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合而成，已含有 1xLoading Buffer, 可以直接電泳。包括 11 條雙鏈 DNA片斷：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp 和 1500bp。特異性加強(qiáng) 500bp。每次上樣 4 5 L。6. 模板一般采用 50ng-1ug 或 102-105 拷貝，濃度過高反而會抑制反應(yīng)的進(jìn)行。7. 引物的與模板的互補(bǔ)程度決定了 PCR的特異性，常用 0.1 0.5uM，濃