銀杏葉總多酚抑菌效果的研究

1、.銀杏葉總多酚抑菌效果的研究生物科學專業(yè) 學生：劉詩琴 指導老師：何麗芳摘 要：目的探究銀杏葉總多酚對供試細菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、傷寒桿菌）的抑菌活性。方法采用濾紙圓片法，測定銀杏葉總多酚在不同質(zhì)量濃度、pH值、溫度下對供試細菌產(chǎn)生抑菌圈的直徑大小。結(jié)果銀杏葉總多酚對供試細菌有較強的抑菌活性，隨著銀杏葉總多酚質(zhì)量濃度的增加，其抗菌活性顯著增強；銀杏葉總多酚對供試細菌的最低抑菌濃度不超過0.4mg/mL，最佳抑菌濃度為4mg/mL；在和中性和偏酸性PH條件下，抑菌活性較強；銀杏葉總多酚溶液具有熱穩(wěn)定性，一定溫度范圍內(nèi)處理不影響其抑菌活性。結(jié)論銀杏葉總多酚具有較強的抑菌活性，

2、可用于食品貯存與加工。關(guān)鍵詞：銀杏葉總多酚；供試細菌；抑菌濃度目前國內(nèi)外抑菌方式主要集中在抑菌藥物的研發(fā)上，青霉素、鏈霉素等抗生素類藥物使用頻繁，然而抗生素的大量使用會引發(fā)細菌耐藥性、人體過敏反應等一系列不良后果1。因此，尋找一種無毒、高效的抑菌藥物有著非常重要的臨床意義。植物總多酚是一類廣泛存在于各種植物體內(nèi)的多酚類物質(zhì)的總稱，具有清除體自由基、抗脂質(zhì)氧化、抗突變、防癌等生物學功能2-4。其中茶多酚、葡萄多酚是研究較多的素材，廣泛地應用于食品、醫(yī)藥，精細化工研究等方面5-10。然而對于銀杏葉總多酚抑制常見細菌作用效果的研究尚無報道。本研究以銀杏葉總多酚作用于供試細菌（大腸桿菌、傷寒桿菌、金黃

3、色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌），探究銀杏葉總多酚的抑菌效果，為銀杏葉總多酚的綜合利用及開發(fā)提供參考依據(jù)。1 材料與方法1.1材料1.1.1實驗儀器BCD-216YHN冰箱；SZ-93自動雙重水蒸餾器；YX280A電熱手提蒸汽消毒器；WP800TLZ3-K3微波爐；DHG-90LLOA型電熱恒溫鼓風干燥箱；SPX-150BSH-III生化培養(yǎng)箱；SWCJ-A潔凈工作臺；FA2004N電子天平。 1.1.2實驗試劑牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、無菌水、銀杏葉總多酚粉末1.1.3供試菌種由本系微生物實驗室提供：大腸桿菌（Escheriechia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus

4、aureus）、傷寒桿菌（Typhoid bacacillus）、枯草芽孢桿菌（Baeillussubtili）。1.2方法1.2.1懸菌液的制備吸取50 mL已滅菌的生理鹽水于分別標有各種供試菌種的三角瓶中，再用接種環(huán)挑取少量不同菌種加入到對應的無菌試管中，震蕩10 min，用血球計數(shù)板檢測，控制菌懸液含菌約105 cfu/mL，備用（注：以上操作都需在無菌環(huán)境下執(zhí)行，所需的玻璃器材均需120 高溫滅菌30 min再烘干。）1.2.2最低抑菌濃度（MIC）的測定分別將滅菌后的濾紙圓片（直徑為10 mm）置于質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的銀杏葉總多酚水溶

5、液中，浸泡12 h之后，取出，瀝干，備用。向滅菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基分別加入100 L的菌懸液，然后再用三角玻璃涂布器涂布均勻。最后將瀝干的濾紙圓片分別貼在含菌平板表面，呈三角形。倒置培48 h后觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。重復2個平板。以不加銀杏葉多酚溶液只加菌懸液為對照。1.2.3最佳抑菌質(zhì)量濃度的測定分別將滅菌后的濾紙圓片置于質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL的銀杏葉總多酚水溶液中，浸泡12h之后，取出，瀝干，備用。向滅菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基分別加入100 L的菌懸液，然后再用三角玻璃涂布器涂布均勻。最后將瀝干的濾紙圓片分別貼在含菌平板表

6、面，呈三角形。倒置培養(yǎng)48h后觀察并測量抑菌圈直徑大小。重復2個平板。將實驗結(jié)果所得的最佳抑菌濃度設為以下實驗中的銀杏葉總多酚溶液的質(zhì)量濃度。1.2.4 pH值對抑菌活性的影響將滅菌后的濾紙圓片置于用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)配成6個pH值梯度（4- 5、 5- 6、6- 7、7-8、 8-9、 9-10）的銀杏葉總多酚溶液中，浸泡12h之后，取出，瀝干，備用。向滅菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基分別加入100 L的菌懸液, 然后再用三角玻璃涂布器涂布均勻。最后將瀝干的濾紙圓片分別貼在含菌平板表面，呈三角形。倒置培養(yǎng)48 h后觀察并測量抑菌圈直徑大小。重復2個平板。1.2.5溫度對抑菌活性的影響分別取最佳抑菌

7、質(zhì)量濃度下的銀杏葉總多酚溶液10ml于6支試管中，然后分別在4、24、50、75、85、100六個溫度下處理不同時間,再將滅菌后的濾紙圓片浸泡于各試管中12h，取出，瀝干，貼在含菌平板表面，呈三角形。倒置培養(yǎng)48 h后觀察并測量抑菌圈直徑大小。重復2個平板。2 結(jié)果與分析2.1 銀杏葉總多酚的最低（MIC）和最佳抑菌質(zhì)量濃度的測定對銀杏葉總多酚的最低抑菌濃度進行了測定，結(jié)果如表1所示，傷寒桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為0.2mg/mL，大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.4mg/mL。表1 銀杏葉總多酚最低抑菌濃度試驗結(jié)果大腸桿菌傷寒桿菌枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌E. coli

8、T. bacacillusB. subtiliS. aureus質(zhì)量抑菌抑菌圈質(zhì)量抑菌抑菌圈質(zhì)量抑菌抑菌圈質(zhì)量抑菌抑菌圈濃度/效果直徑/mm濃度/效果直徑/mm濃度/效果直徑/mm濃度/效果直徑/mm(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation InhibitionMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneConcentr

9、ation diameterConcentration diameterConcentration diameterConcentration diameter1.0+13.61.0+12.81.0+13.41.0+13.40.8+12.40.8+12.40.8+12.40.8+13.80.6+12.20.6+11.80.6+11.80.6+11.40.4+10.80.4+13.60.4+10.80.4+12.60.2-10.00.2+11.20.2+11.40.2+10.80.1-10.00.1-10.00.1-10.00.1-10.0對照-10.0對照-10.0對照-10.0對照-10.0

10、最低抑菌濃度(mg/mL)0.40.20.20.2注：濾紙圓片直徑為10 mm，+為有抑菌活性；為無抑菌活性。最佳抑菌濃度如表2所示，在銀杏葉總多酚的質(zhì)量濃度為3.0mg/mL時，金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大，即為最佳抑菌濃度。大腸桿菌、傷寒桿菌和枯草芽孢桿菌的最佳抑菌濃度為4.0mg/mL，當銀杏葉總多酚質(zhì)量濃度達到4.0mg/mL以上時，抑菌圈的增大幅度較小，考慮到經(jīng)濟成本，選擇4.0mg/mL銀杏葉總多酚做后續(xù)抑菌穩(wěn)定性試驗。表2 不同梯度濃度的銀杏葉總多酚抑菌試驗結(jié)果大腸桿菌傷寒桿菌枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌E. coliT. bacacillusB. subtiliS. aureus質(zhì)

11、量抑菌抑菌圈質(zhì)量抑菌抑菌圈質(zhì)量抑菌抑菌圈質(zhì)量抑菌抑菌圈濃度/效果直徑/mm濃度/效果直徑/mm濃度/效果直徑/mm濃度/效果直徑/mm(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation InhibitionMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneConcentration diameterConcentration diame

12、terConcentration diameterConcentration diameter8.0+18.68.0+13.88.0+17.88.0+12.27.0+16.27.0+14.67.0+15.67.0+14.46.0+18.46.0+15.66.0+17.46.0+13.85.0+16.85.0+14.85.0+18.45.0+15.44.0+17.84.0+16.44.0+20.64.0+14.83.0+15.43.0+14.83.0+16.23.0+16.42.0+15.22.0+14.22.0+14.42.0+14.21.0+13.61.0+12.81.0+13.41.0+1

13、3.4最佳抑菌濃度(mg/mL)4.04.04.03.02.2 pH值對銀杏葉總多酚抑菌活性的影響圖1.a可知，銀杏葉總多酚在堿性環(huán)境條件下對大腸桿菌的抑菌效果比酸性條件下的抑菌效果好，在pH值為7-9條件下，抑菌效果較強，隨著pH值得降低，抑菌效果減弱。由圖1.bcd可知，當pH值為中性或弱酸條件下，其對傷寒桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性較高，而當pH值為強酸或強堿時，銀杏葉總多酚的抑菌活性降低。 a.不同pH值下對大腸桿菌的抑制效果b.不同pH值下對金黃色葡萄球菌的抑制效果 d. 不同pH值下對傷寒桿菌的抑制效果c.不同pH值下對枯草芽孢桿菌的抑制效果 圖1 不同pH值下銀杏

14、葉總多酚對供試細菌的抑菌活性影響2.3 溫度對銀杏葉總多酚抑菌活性的影響銀杏葉總多酚經(jīng)不同溫度處理后對供試菌種的抑菌效果，結(jié)果見表3所示。經(jīng)低溫長時間放置和高溫短時間加熱處理后，供試菌的抑菌圈變化不大，但當溫度高于85時，其抑菌活性下降，可能是高溫破壞了總多酚結(jié)構(gòu)的緣故，銀杏葉總多酚的抑菌活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。由此可知，銀杏葉總多酚具有較好的常溫抑菌活性。表3 不同溫度對銀杏葉總多酚的抑菌活性的影響 溫度菌種抑菌圈直徑（mm）42d241d502h7530min8510 min1002min大腸桿菌15.616.414.213.413.412.8傷寒桿菌16.415.813.814.214.2

15、12.6枯草芽孢桿菌17.217.615.414.812.811.2金換色葡萄球菌 15.415.612.812.613.311.8注：銀杏葉總多酚質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL3 討論抑菌試驗選取了具有代表性的2種革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和2種革蘭陰性菌大腸桿菌、傷寒桿菌作為試驗材料，研究了銀杏葉總多酚的抑菌作用。結(jié)果表明銀杏葉總多酚具有廣譜抑菌作用。金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度為是0.2 mg/mL，大腸桿菌為0.4mg/mL。伴隨銀杏葉總多酚溶液的質(zhì)量濃度增加，抑菌效果明顯增強，并顯示濃度-效應正相關(guān)關(guān)系，最佳抑菌濃度為4.0 mg/mL。pH值影響銀

16、杏葉總多酚的抑菌活性，銀杏葉總多酚在中性或者偏酸性的環(huán)境下穩(wěn)定，pH值為6-7的時候抑菌活性最強，隨著酸堿度的增加，銀杏葉總多酚的抑菌活性下降，可能是因為強酸強堿對試驗菌有抑制作用，也可能與銀杏葉總多酚抑菌活性成分的性質(zhì)有關(guān)。低溫長時間放置和一定范圍內(nèi)的高溫短時間加熱對銀杏葉總多酚抑菌活性的影響不大，但過高的溫度有可能破壞總多酚的結(jié)構(gòu)，使抑菌效果降低。銀杏葉總多酚是一種混合物，主要由花青素、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸等多酚類物質(zhì)組成11-12，要具體到銀杏葉總多酚中何種物質(zhì)對細菌起到抑制作用，還有待進一步的研究證明。此外，要將銀杏葉總多酚作為一種食品添加劑或者作為抑菌藥物實際使用，如何添加其用

17、量，如何取得實際最佳的抑菌效果，尚需進一步的研究?！緟⒖嘉墨I】1 儀淑敏.茶多酚對魚糜制品的冷藏保鮮作用及抑菌機理D.杭州:浙江工商大學,2011,3(14):76-79.2 宋立江,狄瑩,石碧.植物多酚研究與利用的意義及發(fā)展趨勢J.化學進展,2000,12(2):161-1623 劉賢銘.植物多糖的抗腫瘤作用研究J.中國藥房,2005,16(19):1502-1503.4 李莉.蘋果多酚抗氧化性的測定J.安徽農(nóng)業(yè)科學,2006,34(21):71-74.5 李春美,田燕,鐘慧臻,等.芒果核提取物的抑菌活性組分分析J.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,2011,3(3),172-175.6 彭慧

18、琴,蔡衛(wèi)民,項哨.茶多酚體外抗流感病毒 A3 的作用J.茶葉科學,2003,23(1):79-8l.7 Tapiero H, Tew K D. Polyphenols: Do They Play A Role in the Prevention of Human PathologiesJ. Biomed Pharmacother, 2002,56(1):200-207.8 劉運榮,胡建華.植物多酚的研究進展J.武漢工業(yè)學院學報,2005,4(12):64-65.9 王岳飛.茶多多酚解酒作用的實驗研究J.茶葉,2003,29(3):145-147.10 王世紅.銀杏葉現(xiàn)代藥理應用及其機制的研究進

19、展J.基層中藥雜志,2001,3(5):52-53.11 林清洪, 黃維南,林光榮,等. 銀杏資源的合理開發(fā)與利用J. 福建農(nóng)業(yè)科技,2006,4(3):15-16.12 江德安. 葉用銀杏研究進展J. 孝感學院學報,2002,17(6):63-66.Study on Anti-microbial Activities of Total Polyphenol from Leaves of GinkgoStudent:Liu Shi-qin Tutor:He Li-fangAbstract: Objective The anti-microbial activities of total pol

20、yphenol from leaves of Ginkgo on test bacteria (Escheriechia coli、Staphylococcus aureus、Typhoid bacacillus、 Baeillussubtili aureus ) were studied. Method Measuring the diameter of inhibition zone under different conditions including concentration of total polyphenol from leaves of Ginkgo, pH value a

21、nd temperature processing by filtering paper method. Results The total polyphenol from leaves of Ginkgo had strong inhibition on test bacteria, with the increase of the concentration of total polyphenol from leaves of Ginkgo, the anti-microbial activities increased significantly. The minimnm anti-microbial concentration of the total polypheol from leaves of Ginkgo was no more than 0.4mg/mL and the optimum anti-microbial c