小柴胡顆粒中黃芩苷含量測(cè)定的不確定度評(píng)定

1、小柴胡顆粒中黃芩苷含量測(cè)定的不確定度評(píng)定測(cè)量不確定度是表征合理賦予被測(cè)量之值的分散性， 與測(cè)量 結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)， 是用來確定測(cè)量結(jié)果的可信程度 1 。目前， 測(cè)量不確定度在藥品檢驗(yàn)分析領(lǐng)域的應(yīng)用也日益廣泛 2-3 。筆 者根據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定與表示 1 ，并參考化學(xué)分析中 不確定度的評(píng)估指南 4 ，對(duì)中國(guó)藥典 2010 年版一部小柴 胡顆粒5中黃苓苷的HPLC含量測(cè)定進(jìn)行不確定度分析，以期找 出影響不確定度的因素，并對(duì)其評(píng)定，計(jì)算合成不確定度，給出 測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度，為測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確提供依據(jù)。1 儀器和試藥1.1 儀器 Waters2695-2487 高效液相色譜儀；德國(guó) sartor

2、ius 電子分析天平（型號(hào)： CP225D、 CP224S）。1.2 材料 黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)： 110715-201318，中國(guó)藥品 生物制品檢定所提供）；小柴胡顆粒（批號(hào)： 140506，廣州白云 山光華制藥XX公司）。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑 為分析純。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1色譜條件 色譜柱：資生堂 MG C18 （250X 4.6mm5卩m）;流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（47: 53: 0.2 ）;檢測(cè)波長(zhǎng)： 315nm;柱溫：30C ；流速：1.0ml/min。理論板數(shù)按黃苓苷峰計(jì) 算不低于 8000。2.2對(duì)照品溶液的制備 稱取黃苓苷對(duì)照品約12mg精密稱 定，置 50ml 容量

3、瓶中，加 70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻， 精密吸取 5ml 置 20ml 容量瓶中，用 70%乙醇稀釋至刻度，制成 每1ml含黃苓苷60卩g的溶液，作為對(duì)照品溶液8。2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，混勻，取 適量，研細(xì)，取約3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 70%乙醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 250W頻率 50kHz） 30min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量， 搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液 8 。2.4 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10卩l(xiāng)，注入液相色譜儀，測(cè)定，按外標(biāo)法（峰面積）計(jì)算出樣 品中黃芩苷的含量。

4、2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 小柴胡顆粒的平均裝量為 10.2283g/ 袋，其 余數(shù)據(jù)見表 1、2。3 測(cè)量數(shù)學(xué)模型的建立根據(jù)測(cè)定原理，黃芩苷含量計(jì)算公式如下：X=A樣xw對(duì)xp對(duì)XV樣x WV寸XA對(duì)xw樣式中：供試品每袋含黃苓苷的含量（mg/袋）；A樣：供試 品的峰面積；A對(duì)：對(duì)照品的峰面積；W對(duì)：對(duì)照品的稱取量（mg）; W樣：供試品的取樣量（g） ; P對(duì)：對(duì)照品的純度（% ; V樣: 樣品的稀釋體積（ml）; V對(duì)：對(duì)照品的稀釋體積（ml）; W-： 平均裝量（g/袋）。4 不確定度來源的識(shí)別及分析4.1 不確定度的來源 由上述實(shí)驗(yàn)過程和數(shù)學(xué)模型可知，影 響小柴胡顆粒中黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果的不確

5、定度因素有： 供試品 和對(duì)照品稱量過程、 稀釋過程； 儀器測(cè)定供試品和對(duì)照品峰面積 的重復(fù)性；樣品平均裝量的稱量；對(duì)照品的純度以及其它因素。 幾個(gè)分量的影響因素相互獨(dú)立， 按測(cè)量不確定度評(píng)估程序， 分別 進(jìn)行不確定度的分析評(píng)估。4.2 對(duì)照品引入的不確定度4.2.1 對(duì)照品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度： 稱量使用德國(guó) sartoriusCP225D 電子分析天平（ Max80g， d=0.01mg），為1級(jí)工作天平。天平示值不確定度：天平的檢 定證書給出其示值最大允差為土 0.05mg （0< me 5000mg，按均 勻分布k=3計(jì)算，不確定度為 卩仁0.053 = 2.89 X 10

6、- 2mg。 天平稱量重復(fù)性不確定度： 天平檢定證書給出的重復(fù)性誤差為 0.02mg,按照均勻分布計(jì)算，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為卩2=0.023 =1.15 X 10 - 2mg。天平引入的不確定度為卩=叮2+卩22 =3.11 X 10 - 3 ，由于對(duì)照品采用的是減重法稱量，稱量了兩次， 所以對(duì)照品 1 稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度， 同理對(duì)照品 2稱量 引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。對(duì)照品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定 度。4.2.2 對(duì)照品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 黃芩苷對(duì)照品 （批號(hào)： 1 1 071 5-20 1 3 1 8 ，中國(guó)藥品生物制品檢定所）未提供不確定度值，假設(shè)分布區(qū)間的半峰寬為±

7、; 0.05%，按均勻分布 k=3， 故由對(duì)照品純度而引入的相對(duì)不確定度urel （P 對(duì)）=0.053 X 93.3%=3.10X 10-44.2.3 對(duì)照品稀釋引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 玻璃儀器校 準(zhǔn)的不確定度： 屬 B 類不確定度。 對(duì)照品稀釋過程中用到容量瓶 50ml （A級(jí)）、20ml （A級(jí)），單標(biāo)線吸管 5ml （A級(jí)），容量允 差分別為± 0 . 0 5 、 ± 0 . 0 3 、 ± 0 . 0 1 5 ，在一個(gè)有效的生產(chǎn)過程中 標(biāo)定值比極限值出現(xiàn)的可能性更高， 按三角分布計(jì)算優(yōu)于均勻分 布，k=6。溫度：實(shí)驗(yàn)時(shí)容量瓶、吸管和溶液的溫度與玻璃儀 器

8、校準(zhǔn)（20C）的溫度差異變化為土 5C,水的膨脹系數(shù)為2.1 X 10-4，屬于B類不確定度，按矩形分布評(píng)定。由表3結(jié)合對(duì)照品的稀釋過程，對(duì)照品稀釋引入的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 為： urel （V 對(duì)） =u2rel （ V50） +u2rel （V25） +u2rel （ V5） =1.43X10-3。4.2.4 對(duì)照品峰面積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel （A對(duì)）對(duì)照品溶液A對(duì)1、A對(duì)2分別進(jìn)樣2次， 均以色譜峰面積計(jì)算。對(duì)照品溶液 1 峰面積分別為 1312423和 1312944，平均峰面積為 1312684 采用極差法計(jì)算， n=2， C=1.13， 同理對(duì)照品溶液 2峰面積分別為

9、 1262733和 1266039，對(duì)照品峰 面積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確度。4.3 供試品引入的不確定度4.3.1 供試品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 稱量使用德國(guó) sartoriusCP224S 電子分析天平（Max220g d=0.1mg），為 1 級(jí)工作天平。 天平示值不確定度： 天平的檢定證書給出其示值最大允差為土 0.5mg （50gW me 200g），按均勻分布k=3計(jì)算，不確定度為u1=0.53 =0.2887mg。天平稱量重復(fù)性不確定度：天 平檢定證書給出的重復(fù)性誤差為0.1mg，按照均勻分布計(jì)算，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 u2=0.13 = 0.0577mg 。天平引入的不確定度為 u=

10、u2+ u22=0.2944，所以供試品1稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 為；同理，供試品2稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為9.81 X 10-5 ,則供試品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel （W羊）=u2rel （W樣 1） +u2rel （W羊 2） 2=9.81 X 10-54.3.2 供試品稀釋過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 供試品配 制過程中只使用了 1個(gè)A級(jí)50ml單標(biāo)線吸管，容量允差土 0.05 , 按三角分布：k=6，引入的相對(duì)不確定度為 7.31 X 10-4 （見表3）。4.3.3 供試品峰面積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 供試品溶液 各進(jìn)樣 2 次，均以色譜峰面積計(jì)算。采用極差法計(jì)算，

11、 n=2， C=1.13;進(jìn)樣 10 卩 l 時(shí) urel （A 樣 1） =RCXA 樣仁2643964-26356711.13 X 2639817=2.78 X 10 -3 , urel （A 樣 2） =RCXA 樣 2=2645071 -26380731.13 X 2641772=2.21 X 10 -3 供試 品峰面積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度： urel （A樣）=urel2 （A樣） +urel2 （A樣 2） 2=2.51 X 10-34.3.4 供試品平均裝量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 urel （W） 本品平均裝量 10.2283g/ 袋，參照供試品稱量引入的相對(duì)不確定 度，平均裝

12、量引入的相對(duì)不確定度 urel （W） =uW=0.294410228.3=2.87 X 10-54.4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 各相對(duì)不確定度分量見表 4。4.5 擴(kuò)展不確定度 本品測(cè)得小柴胡顆粒中黃芩苷含量X=20.2mg/袋，測(cè)得結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：uc (X) =XX urel(X) =20.2 X 5.04 X 10-3=0.101mg/ 袋。按95%的置信概率，取包含因子k=2,擴(kuò)展不確定度：U=kx uc(X)=2X 0.101=0.2mg/ 袋。4.6 不確定度測(cè)量報(bào)告 根據(jù)不確定度評(píng)定結(jié)果，小柴胡顆粒中黃苓苷的含量測(cè)定結(jié)果可表示為：X=(20.2 ± 0.2)m

13、g/袋。5 討論 試驗(yàn)對(duì)小柴胡顆粒中黃芩苷含量進(jìn)行了不確定度分析評(píng)定， 由評(píng)定結(jié)果可以看出(見表 1 )，測(cè)得色譜峰面積、對(duì)照品稱量 和對(duì)照品稀釋過程對(duì)不確定度貢獻(xiàn)比較大， 對(duì)照品純度、 樣品稱 量及樣品稀釋過程、樣品的平均裝量對(duì)不確定度貢獻(xiàn)較小。不確定度評(píng)定結(jié)果提示， 在今后在實(shí)際檢驗(yàn)過程中， 首先要 保證實(shí)驗(yàn)所用的儀器、 計(jì)量器具等均應(yīng)計(jì)量檢定合格， 并注意日 常的維護(hù)和保養(yǎng)， 對(duì)照品的稱量應(yīng)選擇合適量程及精度的電子分 析天平， 以提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性； 其次在實(shí)驗(yàn)時(shí)適當(dāng)增加 對(duì)照品的取樣量、 稀釋過程盡可能選用容量相對(duì)較大的量具并盡 可能減少稀釋步驟， 增加平行樣測(cè)定， 也可以適當(dāng)減少不確定度 分量所占的比重。采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行定量分析時(shí)， 應(yīng)盡量使配制的樣品組分 的濃度與對(duì)照品濃度接近， 以降低實(shí)驗(yàn)誤差。 本文中供試品溶液按標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)進(jìn)樣10卩l(xiāng)，樣品中黃苓苷的峰面積是黃苓苷對(duì)照品 峰面積的兩倍，測(cè)定結(jié)果為 20.2mg/袋；而進(jìn)樣5卩l(xiāng)，樣品中黃 芩苷的峰面積與黃芩苷對(duì)照品峰面積接近，測(cè)定結(jié)果為 19.3mg/ 袋。兩個(gè)測(cè)定結(jié)果一個(gè)高于限度，一個(gè)低于限度，但不確定度基 本相同。分析其原因是供