翅果油樹葉片多糖抗氧化活性研究

1、翅果油樹葉片多糖抗氧化活性研究        【摘要】     目的從翅果油樹葉片中提取多糖，并分析其體外抗氧化活性。方法采用熱水浸提-乙醇沉淀法制備翅果油樹多糖，采用碘量法測(cè)定各級(jí)多糖對(duì)豬油抗氧化性能的影響，用鄰苯三酚自氧化法、番紅花紅光度法測(cè)定各級(jí)多糖對(duì)超氧陰離子、羥基自由基的抑制作用。結(jié)果多糖的總提取率為0.897%，其中乙醇的體積為提取液的1倍時(shí)，所得多糖的產(chǎn)量最大，為0.524%。各級(jí)多糖對(duì)動(dòng)物油脂過氧化的抑制活性相當(dāng);乙醇用量為提取液的3倍時(shí)，所得多糖對(duì)

2、羥基自由基清除率最大，為77.55%;乙醇用量為提取液的6倍時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率達(dá)最大，所得多糖為34.54%。結(jié)論翅果油樹葉片各級(jí)多糖均能有較地清除自由基，并且各級(jí)多糖對(duì)動(dòng)物油脂的過氧化有較強(qiáng)的抑制作用，從而提高油脂的穩(wěn)定性。     【關(guān)鍵詞】  翅果油樹; 多糖; 抗氧化活性    Abstract：ObjectiveTo extract the polysaccharide from the Laminae of Elaeagnus mollis Diels and analyze its a

3、ntioxidant activity.MethodsElacagnus mollis Diels polysacharide(EDPs) was extracted with hot water as extractait and precipiated by ethanol.The antioxidant activites of EDPs were tested with respect to some parameters,such as the antioxidantive stability to lard ,the scavenging ability on hydroxyl r

4、adical and superoxide anion.ResultsWhen the quantity of alcohol was equal to the volume of EDPs filtrate, yield of EDPs was the highest (0.542%) and the total yield of EDPs was up to 0.897%.The antioxidant activity of the EDPs to lard was almost the same .When the quantity of alcohol was 3 times the

5、 volume of EDPs filtrate,the elimnination rate of the production to·OH could reach to the highest vaule of 77.55%.When the quantity of alcohol was 6 times the volume of EDPs filtrate,the elimination rate of the production to O2-·could reach to the highest value of 34.54%.ConclusionThe EDPs

6、 has the effect of seavenging radical.It has a remarkable antioxidant effect on the lard and can effectively delay the reaction of oxidation.Key words： Elacagnus mollis Diels; Polysaccharide ; Antioxidant activity翅果油樹Elacagnus mollis Diels又名澤綠旦、柴禾、車勾子等，屬胡頹子科，胡頹子屬，落葉禾木1。翅果油樹起源于古老的第三紀(jì)時(shí)期，是現(xiàn)存第四紀(jì)冰川作用后殘存的

7、孑遺作物之一，為我國特有樹種。翅果油樹是一種具有較高生態(tài)效益的木本植物，并是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的稀有植物資源。其各個(gè)器官中均含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是葉片中氨基酸含量較高，并且富含人體必需的8種氨基酸，已有研究報(bào)道翅果油樹葉片中含有黃酮類化合物，同時(shí)其葉片中還含有大量的微量元素、維生素以及糖類。已有研究表明翅果油樹葉片中含有榭皮素、楊梅黃酮、蘆丁等黃酮類化合物，這為研制治療心血管類疾病藥物提供了依據(jù)2，而翅果油樹葉片生物堿經(jīng)證實(shí)有很好的清除自由基及抑菌活性3，4。翅果油樹種仁含有棕櫚酸，油酸，亞油酸，亞麻酸4種主要的脂肪酸，種仁對(duì)高血壓病、高血脂、減少動(dòng)脈粥樣硬化有良好的功效5。多糖是生物體中廣泛

8、存在的物質(zhì)，是生物體內(nèi)重要的大分子，是維持生命活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一。大量研究表明，多糖除具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)外，還有抗衰老、降血糖、抗凝血等作用，且對(duì)機(jī)體副作用小6。多糖還可以應(yīng)用于保健食品方面，少劑量的活性多糖是防止衰老、增強(qiáng)免疫的佳品。目前，關(guān)于翅果油樹多糖的研究鮮有報(bào)道，本文就翅果油樹多糖的抗氧化活性進(jìn)行了研究，以期為合理開發(fā)該植物資源提供一定的理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 植物材料翅果油樹，經(jīng)山西師范大學(xué)閆桂琴教授鑒定。2008-09于翼城縣甘泉林場(chǎng)采集翅果油樹葉片。將采集的翅果油樹葉片洗凈，烘干后粉碎，過60目篩，放入保鮮袋中備用。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲

9、線的制作采用苯酚-硫酸法7，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取105干燥至恒重的無水葡萄糖20 mg，將其定容至500 ml，分別吸取葡萄糖溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 ml于試管中，用水補(bǔ)到2.0 ml，然后加入6%的苯酚1.0 ml及 濃H2SO4 5.0 ml，沸水浴20 min搖勻，在490 nm處測(cè)吸光值，以2.0 ml蒸餾水按同樣顯色操作為空白，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程為：Y=0.009 7X-0.031 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.995。1.2.2 翅果油樹葉片中多糖的提取采用熱水浸提法8，稱取60 g粉碎的翅果

10、油樹葉片粉末采用石油醚回流脫脂，95%乙醇脫去小分子的糖、生物堿等雜質(zhì)。蒸餾水提取，得提取液。 提取液經(jīng)減壓濃縮，Sevage法(氯仿正丁醇=41)脫蛋白。將所得濃縮液依次加入體積為1，2，3，4，5，6，7倍于濃縮液體積的95%乙醇分級(jí)沉淀多糖。依次用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀，常規(guī)干燥。將各級(jí)多糖定容到100 ml，采用苯酚-硫酸法測(cè)定各級(jí)多糖濃度，通過計(jì)算出多糖的總量得到翅果油樹多糖得率。1.2.3 翅果油樹葉片中各級(jí)多糖的理化性質(zhì)分析9莫氏反應(yīng)、苯酚-硫酸反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、賽氏反應(yīng)、本尼迪克特反應(yīng)。1.2.4 脂質(zhì)抗氧化活性的測(cè)定參照宋永生等10方法略加改

11、進(jìn)，取精煉豬油25 g，置于250 ml的三角瓶中，分別加入0.5 mg/ml的各級(jí)多糖溶液，每組兩個(gè)平行樣，同時(shí)用蒸餾水作空白對(duì)照組，每個(gè)樣品充分?jǐn)嚢韬蠹由w，置于(60±1)的電熱鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行加速氧化，每隔3天按照GB5009.37-199611的標(biāo)準(zhǔn)方法, 定期取樣測(cè)定豬油在放置過程中的過氧化值(pov)并以此來表示油脂的氧化速度， 進(jìn)而衡量提取物的抗氧化性。1.2.5 對(duì)超氧陰離子(O2-·)的清除作用的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法12測(cè)定翅果油樹葉片各級(jí)多糖對(duì)超氧陰離子的清除。取0.05 mol/L pH=8.2 Tris-HCl緩沖液4.5 ml于試管中，置于2

12、5水浴中預(yù)熱25 min，分別加入0.1 ml的0.5 mg/ml的各級(jí)多糖試樣液。2.5 mmol/L鄰苯三酚0.4 ml，以蒸餾水為空白，混勻后于25水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，立即用8 mol/L的HCl兩滴終止反應(yīng)，并在299 nm處測(cè)其吸光值。清除率R(%)=A對(duì)照-A樣品A對(duì)照×100%其中， A對(duì)照為蒸餾水組的光吸收值;A樣品為加入翅果油多糖液各組的吸光收值。1.2.6 對(duì)羥基自由基(·OH)清除作用的測(cè)定采用張愛梅等13方法略加改進(jìn)測(cè)定翅果油樹葉片各級(jí)多糖對(duì)羥基自由基的清除。取比色管依次加入0.03%的番紅花紅T溶液0.8 ml，0.2 mol/L的H2SO4

13、溶液0.7 ml，0.4 mmol/L的MnSO4 溶液1.6 ml，0.3% H2O2溶液1.2 ml，作為反應(yīng)體系，依順序加入1 ml濃度的翅果油樹葉片多糖液，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置10 min，以蒸餾水作參比，在554 nm處測(cè)定吸光值。用以下公式計(jì)算：清除率R(%)=As-AAo-A×100%式中 As ：加入抗氧化劑溶液的吸光值;Ao ：番紅花紅T和H2SO4作為空白體系的吸光值;A ：未加抗氧化劑的羥基自由基反應(yīng)體系的吸光值。2 結(jié)果2.1 翅果油樹葉片多糖的提取率脫脂后的翅果油樹葉片粉末經(jīng)熱水提取、濃縮、脫蛋白后，將所得的提取液經(jīng)不同量的乙醇分級(jí)沉淀得7種產(chǎn)物，

14、通過苯酚-硫酸法測(cè)定各級(jí)產(chǎn)物的多糖含量，并計(jì)算其相對(duì)于脫脂后的翅果油樹葉片粉末的產(chǎn)率。結(jié)果見表1。表1 各級(jí)多糖含量分析由表1可見，多糖產(chǎn)量與乙醇的用量有關(guān)，當(dāng)乙醇的用量與提取液的體積相同時(shí)，所得多糖的產(chǎn)量最大，提取率達(dá)0.524%，當(dāng)乙醇的用量逐漸加時(shí)，各級(jí)多糖的產(chǎn)量也逐漸減少。用乙醇沉淀多糖是因?yàn)橐掖寄芷茐亩嗵欠肿颖砻娴乃瘜硬⒔档徒殡姵?shù)而增加電離質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，而多糖有多種組分，這些組分的水化層及帶電狀況有所不同，因而，可在不同濃度的乙醇中發(fā)生沉淀，這些產(chǎn)物不僅在量上有所差異，而且其結(jié)構(gòu)和功能也有所不同。2.2 翅果油樹葉片各級(jí)多糖的理化性質(zhì)翅果油樹葉片各級(jí)多糖為淡黃色粉末，溶于水，

15、不溶于高濃度的乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑。由表2知，莫氏反應(yīng)為陽性，苯酚-硫酸反應(yīng)為陽性說明具糖的性質(zhì);碘-碘化鉀反應(yīng)為陰性，說明不含淀粉;茚三酮反應(yīng)為陰性，說明不含蛋白質(zhì);塞氏反應(yīng)、本尼迪克特反應(yīng)為陰性，說明多糖末端殘基不具還原性。表2 各級(jí)多糖理化性質(zhì)分析2.3 翅果油樹葉片各級(jí)多糖對(duì)豬油的抗氧化性能由圖1可知，經(jīng)過翅果油樹葉片各級(jí)多糖處理后的豬油樣品在存放期間，其過氧化值的上升速度較對(duì)照樣品慢，從第6天開始出現(xiàn)明顯差異。隨著時(shí)間的推移，翅果油樹葉片各級(jí)多糖的抗氧化作用表現(xiàn)的越來越明顯。添加翅果油樹葉片多糖的油脂的過氧化值較對(duì)照的過氧化值小，因此可以說明翅果油樹葉片多糖能夠有效的抑制動(dòng)物油

16、脂的氧化。從圖1中還可以看出，各級(jí)多糖的過氧化值變化趨勢(shì)差異不大，說明各級(jí)多糖對(duì)動(dòng)物油脂的抑制作用相當(dāng)。圖1 翅果油樹葉片各級(jí)多糖對(duì)豬油的抗氧化作用2.4 翅果油樹葉片各級(jí)多糖對(duì)O2-·的抑制作用由表3可見，翅果油樹葉片多糖對(duì)O2-·有較強(qiáng)的清除作用，分級(jí)沉淀的各級(jí)多糖對(duì)O2-·的清除作用有明顯差異，且隨乙醇濃度的增加清除率也增加，當(dāng)乙醇體積為6倍，多糖濃度為0.5 mg/ml時(shí)，清除率達(dá)最大，為34.54%。表3 翅果油樹葉片各級(jí)多糖對(duì)O2-·的抑制作用.2.5 翅果油樹葉片各級(jí)多糖對(duì)羥基自由基的抑制作用由表4可知，翅果油樹葉片各級(jí)多糖對(duì)·O

17、H有顯著的清除作用，2，3，4級(jí)作用更加顯著，尤以3級(jí)多糖的清除率最大，可達(dá)77.55%。表4 翅果油樹葉片各級(jí)多糖對(duì)·OH的抑制作用3 結(jié)論生物體內(nèi)自由基繁多，自由基是人體生命過程中生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，體內(nèi)自由基過多或清除緩慢均會(huì)引起分子、細(xì)胞甚至器官損傷，導(dǎo)致病變。因此，自由基作為新的致病因素已引起國內(nèi)外廣大生物學(xué)和醫(yī)學(xué)工作者的極大關(guān)注，經(jīng)證實(shí)，現(xiàn)今有效且應(yīng)用較多的只有維生素C、維生素E和甘露醇等幾種抗自由基藥物14。食用油脂的過氧化也是由自由基引起的油脂氧化后不但破壞了其中的營養(yǎng)成分，損壞了食品風(fēng)味，甚至危害人體健康。自由基會(huì)使人體脂肪與蛋白質(zhì)發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜、

18、組織、酶和基因受損，引起衰老和疾病。因此，研究開發(fā)新的抗氧化劑對(duì)預(yù)防和治療相關(guān)疾病具有重要的意義，對(duì)尋找一些天然的、安全的抗氧化物添加于食品、藥品和化妝品中也是非常必要的。多糖的抗氧化作用和醫(yī)藥功效正倍受人們的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)證明，翅果油樹葉片各級(jí)多糖均能有效的清除自由基，當(dāng)乙醇體積為6倍時(shí)對(duì)O2-·清除率達(dá)最大，當(dāng)乙醇體積為3倍時(shí)對(duì)·OH的清除率最大。并且翅果油樹葉片各級(jí)多糖對(duì)動(dòng)物油脂的過氧化有較強(qiáng)的抑制作用，從而提高了油脂的穩(wěn)定性?？傊?，翅果油樹葉片多糖具有良好抗氧化能力，對(duì)于一些因自由基損傷所引起的疾病有治療價(jià)值，對(duì)防止含脂食品的自動(dòng)氧化有一定的實(shí)用價(jià)值。 &#

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