經(jīng)濟高效的禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立

1、經(jīng)濟高效的禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立侯毅平,周明國基金項目:高校博士點基金(20120097120009作者簡介:侯毅平,(1984-,男,講師,主要研究方向:殺菌劑毒理與抗藥性。通信聯(lián)系人:周明國,(1958-,男,教授,主要研究方向:植物病害化學(xué)防治。E-mail: mgzhou(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,南京 2100955 摘要:禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum 原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是建立禾谷鐮孢菌突變體文庫及研究其功能基因組的一種重要方法,本文以抗氰烯菌酯的禾谷鐮孢菌Y2021A 為供試菌株,研究酶解材料、酶組合、酶濃度、酶解時間、酶解溫度和最佳酶解材料

2、的量對禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體制備的影響,優(yōu)化胞壁降解酶系統(tǒng),并將1.7kb 的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片段(hph 轉(zhuǎn)化到供試菌株中,計算轉(zhuǎn)化效率,PCR 驗證轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明,制備禾谷鐮孢10 菌原生質(zhì)體最適宜的條件為每毫升2%崩潰酶(Drislase 和2%蝸牛酶(Snailase 混合酶液中加入0.12 g 幼殖體,30 酶解1.5 h 。hph 片段的轉(zhuǎn)化效率可達 40-50個轉(zhuǎn)化子/g DNA 片段, PCR 檢測表明,hph 已插入轉(zhuǎn)化子的基因組中。該文成功的建立了經(jīng)濟高效的禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺,為建立禾谷鐮孢菌突變體文庫及研究其功能基因組提供了的必要的技術(shù)支持。15關(guān)鍵詞:

3、遺傳學(xué);禾谷鐮孢菌;原生質(zhì)體制備;遺傳轉(zhuǎn)化中圖分類號:Q341Establishing of an economic and efficient genetic transformation system of protoplast for Fusarium20 graminearumHOU Yiping, ZHOU Mingguo(College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, NanJing 210095Abstract: The genetic transformation of protoplast for F

4、usarium graminearum is a important technique of establishing mutation library and studying functional genome. In this research, 25 JS399-19HR strain Y2021A of Fusarium graminearum was used for studying the effect of the different digesting materials, enzyme combination, enzyme concentration, digesti

5、ng time, digesting temperature and weight of the best digesting material on protoplast preparation. Then the DNA segment (1.7kb of hygromycin resistant gene B (hph was transformed into the protoplasts of JS399-19HR strain Y2021A. The efficiency of transformation was calculated and the 30 tranformant

6、s were detected by PCR. The optimum condition for preparing protoplasts was: one milliliter enzyme mixture of 2% Driselase and 2% Snailase digested the 0.12 g germLings at 30 for 1.5 hours. The efficiency of transformation was up to 40-50 transformants per microgram of DNA and the fragment hph had i

7、nserted into the genome of transformants by the identification of PCR. An economic and efficient genetic transformation system of protoplast for Fusarium 35graminearum was successfully established, which was an essential technology for establishing mutation library and studying functional genome Fus

8、arium graminearum.Keywords: Genetics; Fusarium graminearum; Protoplast preparation; Genetic transformation 0 引言40 禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum 是小麥赤霉病(Fusaruim head blight of wheat 的病原菌, 小麥赤霉病是一種世界各地均有發(fā)生的流行性病害,是我國小麥生產(chǎn)中最重要的病害之一1-5。多發(fā)生在穗期多雨、氣候潮濕地區(qū)6-10。在我國,長江中下游冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)發(fā)生最嚴重,長江上游冬麥區(qū)和華南冬麥區(qū)也經(jīng)常發(fā)生11。45原生質(zhì)體技術(shù)

9、是研究絲狀真菌生理、生化、遺傳學(xué)及改良菌種的一種重要方法,為開展絲狀真菌的基因工程研究提供了一條行之有效的途徑12。自1973年Mishra 和Tatum13首次報道粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa的DNA轉(zhuǎn)化以來,利用原生質(zhì)體作為分析遺傳基因的實驗材料以及進行性狀轉(zhuǎn)化已備受關(guān)注。近年來,有關(guān)植物病原真菌原生質(zhì)體的制備研究國內(nèi)外已有較多報道14-19,在原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化中,大量原生質(zhì)體的獲得是前提和關(guān)鍵20。50目前禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體制備的方法已有報道21-25,但是直接引用他們的方法并不能得到理想的原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化或者受到酶價格的限制。本文研究目的是建立經(jīng)濟高效的禾谷鐮孢菌原生

10、質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺,為建立禾谷鐮孢菌突變體文庫及研究其功能基因組提供必要的技術(shù)支持。1材料與方法1.1供試菌株55禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearumY2021A是野生型菌株2021經(jīng)藥劑馴化獲得的對氰烯菌酯表現(xiàn)高抗的菌株。1.2轉(zhuǎn)化片段含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph的質(zhì)粒pKHt(圖1-1由浙江大學(xué)馬忠華教授惠贈, 60擴增潮霉素基因片段的引物為hygbF: GGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGG,hygbR: GGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTG,由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)所用的LA Taq DNA聚合酶購自寶生物工程(大連有限公司

11、(TaKaRa Biotechnology(Dalian Co. Ltd.,TaKaRa LA Taq 25µL PCR反應(yīng)體系:TaKaRa LA Taq(5 U/µL,0. 25 µL;10×LA PCR Buffer II(Mg2+ Free,2.5 µL;MgCl2(25 mmol/L,2.5 µL;dNTP Mixture(各 2.5 65mmol/L,4.0 µL;模板 DNA,約1.0 ng;引物1(20 µmol/L;0.5 µL;引物2(20 µmol/L,0.5 µ

12、L;蒸餾水定容至25µL。反應(yīng)條件為94 10 min; 94 1 min, 65 1min, 72 2min, 34 cycles; 72 10 min; 12 for ever. PCR擴增的hph片段經(jīng)Axygen膠回收試劑盒純化。 70圖1質(zhì)粒pKHt圖譜Fig.1 Plasmid pKHt1.3培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA或馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PS用于菌株的分離、純化、一般培養(yǎng)與保存。3%綠豆湯培養(yǎng)液26用于禾谷鐮孢菌產(chǎn)生分生孢子。YEPD-2G27: 酵母粉3 g,蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1 L;75再生培養(yǎng)基: 酵母粉1 g,酶水解干酪素1 g,瓊脂1

13、6 g,蔗糖274 g,加蒸餾水定容至1 L;覆層培養(yǎng)基: 同再生培養(yǎng)基,用10 g瓊脂糖取代瓊脂并加入終濃度為100 g/mL的潮霉素B便于對轉(zhuǎn)化子的篩選。1.4試劑80酶制劑:崩潰酶(Driselase, D(Sigma公司,裂解酶(Lysing Enzyme, L(Sigma 公司,幾丁質(zhì)酶(Chitinase, C(Sigma公司,蝸牛酶(Smailase, S(北京百泰生化技術(shù)公司。所有酶液用0.7 mol/L NaCl溶液配制,經(jīng)700 g離心2 min后取上清,于-20 保存?zhèn)溆谩?5其他試劑:STC(0.8 mol/L 山梨糖醇, 50 mmol/L CaCl2, 50 mmo

14、l/L Tris-HCl, pH 8.0;SPTC,含40% PEG6000的STC;潮霉素B(hygromycin B,Calbiochem分裝;二硫蘇糖醇(DTT;肝素鈉(5 mg/mL等。1.5原生質(zhì)體制備方法參考Robert H. Proctor et al25和Salch et al28,并做適當(dāng)?shù)男薷?。取適量的酶解材料, 90加入10 mL混合酶液(2.5% D,0.5% L,0.005 % C ,0.7 mol/L NaCl 溶液配制,700 r/min 離心2 min,取上清,30 振蕩(85 r/min酶解1-1.5 h,顯微鏡下用血球計數(shù)板對原生質(zhì)體進行計數(shù),計算原生質(zhì)體數(shù)

15、量,每個試驗設(shè)三個重復(fù)。1.5.1酶解材料的選擇分別用分生孢子、菌絲體和幼殖體(萌發(fā)的分生孢子進行酶解,其它操作步驟同上。95菌絲體、分生孢子和幼殖體的制備如下:分生孢子制備:接種禾谷鐮孢菌菌株Y2021A于PSA培養(yǎng)基,25 培養(yǎng)3 d,取直徑 5 mm菌落邊緣菌絲塊若干塊接種100 mL 3 %綠豆湯培養(yǎng)液中,25 下振蕩(175 r/min培養(yǎng)7 d。2層擦鏡紙過濾,離心,用滅菌水洗滌2次,離心收集。菌絲體制備:挑取培養(yǎng)皿中的菌絲接入PS中, 25 下振蕩(175 r/min培養(yǎng)24 h, 加100入DTT使其濃度為0.0025 mol/L,保持60 min,取出培養(yǎng)物,在勻漿器中研磨,

16、使菌絲斷裂分散,然后離心收集,用0.7 mol/L NaCl洗兩次,即得供試的菌絲體。幼殖體制備:將收集的分生孢子懸浮液接種于100 mL YEPD-2G培養(yǎng)基中,25 下振蕩(175 r/min培養(yǎng)12-14 h,當(dāng)芽管長度達到孢子直徑的3-10倍時,2層擦鏡紙過濾,0.7 mol/L NaCl 溶液洗滌兩次,離心收集幼殖體。1.5.2酶組合對原生質(zhì)體制備的影響105用以上最佳條件,采用2% D、2% L、2% S、2% D + 2% L、2% D + 2% S和2% L + 2% S等6種酶組合制備原生質(zhì)體,其它操作步驟同上。1.5.3酶濃度對原生質(zhì)體制備的影響用以上最佳條件,將最佳酶組合

17、設(shè)置1%、1.5%、2%、2.5%、3%五個濃度制備原生質(zhì)體,其它操作步驟同上。1101.5.4酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響用以上最佳條件,分別酶解 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h, 其它操作同上。1.5.5酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響用以上最佳條件,分別在26 、28 、30 和32 條件下進行酶解,其他操作步115驟同上。1.5.6最佳酶解材料的量對原生質(zhì)體制備的影響用以上最佳條件,分別取0.5、0.8、1、1.2、1.5、2 g最佳酶解材料進行酶解,其他操作步驟同上。1.6原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化120方法參考Andrew G.Tag et al23和Frank J

18、. Maier et al24,并做適當(dāng)?shù)男薷摹Ｓ米罴褩l件制備禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體,將原生質(zhì)體用3層擦鏡紙過濾,0.7 mol/L NaCl 溶液沖洗,1000 g離心5 min,STC洗三次,離心收集,冰上放置備用。取80 L原生質(zhì)體液懸浮液加入轉(zhuǎn)化管中,然后加入20 l SPTC,輕輕混勻,依次加入110 g DNA和5 l肝素鈉溶液,輕輕混勻后冰上放置30 min,加入1mL SPTC溶液輕輕混勻,室溫放置20 min,加入到不高125于43 的100 mL再生培養(yǎng)基中,搖勻,倒平板,25 培養(yǎng)12 h,覆以含100 mg/mL 潮霉素B 的覆層培養(yǎng)基培養(yǎng)3-4 d后挑取抗性轉(zhuǎn)化子。1.7

19、轉(zhuǎn)化子的篩選將轉(zhuǎn)化子在含100 mg/mL 潮霉素B的PSA平板上連續(xù)傳五代,能夠穩(wěn)定生長的即為陽性轉(zhuǎn)化子,保存陽性轉(zhuǎn)化子。1.8轉(zhuǎn)化子的驗證130將禾谷鐮孢菌Y2021A和隨機選取的6個陽性轉(zhuǎn)化子的菌絲分別接入100 mL PS培養(yǎng)基中,25 振蕩(175 r/min培養(yǎng)兩天,收集菌絲,冷凍抽干,CTAB法29提取基因組DNA,以所提取的基因組DNA為模板,PCR擴hph片段(604bp,所用引物為hpha: GCGAAGAATCTCGTGCTTTC,hphb: GATGTTGGCGACCTCGTATT。PCR反應(yīng)所用的rTaq 135DNA聚合酶購自寶生物工程(大連有限公司(TaKaRa

20、Biotechnology(DalianCo. Ltd. TaKaRa rTaq 25µL PCR反應(yīng)體系:TaKaRa Taq(5 U/µL,0.125 µL;10×PCR Buffer(Mg2+ Free,2.5 µL;MgCl2(25 mmol/L,1.5 µL;dNTP Mixture(各2.5 mmol/L,2.0 µL;模板 DNA,約1.0 ng;引物1(20 µmol/L,0.5 µL;引物2(20 µmol/L,0.5 µL;蒸餾水定容至25µL。PCR反應(yīng)

21、條件:94 5 min; 94 30 s, 60 30 s,72 30 s,35 cycles; 72 14010 min; 12 for ever.2結(jié)果與分析2.1酶解材料對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響不同的酶解材料其原生質(zhì)體產(chǎn)量相差很大,用幼殖體制備原生質(zhì)體,其產(chǎn)量遠遠超過以菌絲體和分生孢子為酶解材料制備的原生質(zhì)體(表1,因此幼殖體是制備禾谷鐮孢菌原生145質(zhì)體的最佳材料。表1不同的材料對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Tab.1 Effect of different material on protoplasts yield材料(Material原生質(zhì)體產(chǎn)量(Protoplast yield(107/mL菌

22、絲(Mycelia0.87 ± 0.12bB a分生孢子(Conidiophore0.06 ± 0.02cC幼殖體(Germlings 4.27 ± 0.53aAa 采用LSD法分析了數(shù)據(jù)間的差異顯著性,a:P = 0.05,A:P =0.01。a significant difference analysis according to Fishers protected LSD test. a:P = 0.05,A:P =0.01。1502.2酶組合對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響在所選擇的這6種酶組合中,用崩潰酶和蝸牛酶混合酶液處理幼殖體,原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高,可達4.36

23、×107/mL(表2。真菌細胞壁由幾丁質(zhì)、糖原、蛋白質(zhì)、半纖維素等多種成分構(gòu)成。崩潰酶是一類含有昆布多糖酶、木聚糖酶、纖維素酶的復(fù)合酶,消解細胞壁的能155力比較強,裂解酶也是一種復(fù)合酶,它具有蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶等活性,但是其酶解禾谷鐮孢菌幼殖體的能力很差,這可能與禾谷鐮孢菌的細胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。與崩潰酶相比,崩潰酶和蝸牛酶混合酶液對裂解禾谷鐮孢菌幼殖體細胞壁制備原生質(zhì)體具有明顯的增效作用。與蝸牛酶相比,裂解酶和蝸牛酶混合酶液制備原生質(zhì)體有明顯的減效作用,這可能與酶之間的相互作用有關(guān)。160表2酶組合對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Tab.2 Effect of enzyme combina

24、tion on protoplast yield酶組合(Enzymes combination原生質(zhì)體產(chǎn)量(Protoplast yield(107/mL2%D 1.79 ± 0.24bB a2%L 0.02 ± 0.005dC2%S 0.45 ± 0.13cC2%D±2%L 1.98 ± 0.37bB2%D±2%S 4.36 ± 0.67aA2%L±2%S 0.19 ± 0.06cdCa 采用LSD法分析了數(shù)據(jù)間的差異顯著性,a:P = 0.05,A:P =0.01。a significant diff

25、erence analysis according to Fishers protected LSD test. a:P = 0.05,A:P =0.01。2.3酶濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響165用不同的酶濃度處理幼殖體時發(fā)現(xiàn)2%崩潰酶和2%蝸牛酶混合酶液處理幼殖體可以產(chǎn)生最大量的原生質(zhì)體(表3。雖然高濃度酶液對原生質(zhì)體有損傷作用,但是低濃度酶液對禾谷鐮孢菌幼殖體的酶解作用甚微,這可能與禾谷鐮孢菌的細胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。不同的菌有不同的合適酶濃度及其耐受酶濃度,2%崩潰酶和2%蝸牛酶混合酶液是禾谷鐮孢菌的合適酶濃170度和酶組合。表3酶濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Tab.3 Effect of enzym

26、e concentration on protoplast yield酶濃度(Enzymes concentration原生質(zhì)體產(chǎn)量(Protoplast yield(107/mL1%D + 1%S 0.65 ± 0.11dC a1.5%D + 1.5%S2.68 ± 0.59cB2%D + 2%S 4.29 ± 0.62aA2.5%D + 2.5%S3.67 ± 0.57abAB3%D + 3%S 3.09 ± 0.48bcBa 采用LSD法分析了數(shù)據(jù)間的差異顯著性,a:P = 0.05,A:P =0.01。a significant dif

27、ference analysis according to Fishers protected LSD test. a:P = 0.05,A:P =0.01。1752.4酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響在一個酶解體系中,原生質(zhì)體的數(shù)量等于酶解產(chǎn)生的原生質(zhì)體量減去原生質(zhì)體的消解中國科技論文在線 量。用 2%崩潰酶和 2%蝸牛酶混合酶液處理幼殖體，隨著酶解時間的延長，原生質(zhì)體的釋 放量不斷增加，幼殖體的量不斷減少，原生質(zhì)體的消解量不斷增加，當(dāng)幼殖體的量減少到一 180 定程度，原生質(zhì)體的釋放量開始下降，當(dāng)原生質(zhì)體的釋放量與消解量相等時，也就是酶解 1.5 h 時，原生質(zhì)體的數(shù)量達到最多（圖 2），1.

28、5 h 之后，原生質(zhì)體的消解量大于釋放量， 因此其數(shù)量開始下降。由于酶解時間過長會對原生質(zhì)體有損傷作用，因此酶解 1.5 h 左右是 進行原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的最好時機。 185 圖 2 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 Fig.2 Effect of digesting time on protoplasts yield 2.5 酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 溫度對酶活性影響較大， 適宜的溫度能夠使其發(fā)揮正常的活性。 當(dāng)酶解溫度是 30 時， 190 崩潰酶和蝸牛酶混合酶液的活性最高，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高（圖 3）。 圖 3 溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 Fig.3 Effect of temperatur

29、e on protoplasts yield 195 2.6 幼殖體的量對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 幼殖體的量對原生質(zhì)體制備的影響見圖 4。每毫升酶解液中加入 0.12 g 濕幼殖體時，產(chǎn) 生的原生質(zhì)體最多， 每毫升酶解液中濕幼殖體量超過或小于 0.12 g 時都使原生質(zhì)體產(chǎn)生的數(shù) 量減少，因此,每毫升酶解液中應(yīng)選用 0.12 g 濕幼殖體以獲得最多的原生質(zhì)體。 -6- 中國科技論文在線 200 圖 4 幼殖體的量對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 Fig.4 Effect of the weight of germLings on protoplasts yield 2.7 轉(zhuǎn)化子的篩選 從覆蓋培養(yǎng)基上（圖 5

30、）挑取轉(zhuǎn)化子于在含 100 mg/mL 潮霉素 B 的 PSA 平板上，連續(xù) 205 傳五代，能夠穩(wěn)定生長的即為陽性轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化效率可達 40-50 個轉(zhuǎn)化子/ g DNA 片段。 圖 5 轉(zhuǎn)化子 Fig.5 Transformants 210 2.8 轉(zhuǎn)化子的驗證 以菌株 Y2021A 和隨機挑取的 6 個轉(zhuǎn)化子基因組 DNA 為模板，擴增部分 hph 片段，發(fā) 現(xiàn) 6 個轉(zhuǎn)化子都能擴增出 604bp 的 hph 片段， 而菌株 Y2021A 不能擴增出 hph 片段 （圖 6） ， 這說明 hph 已插入轉(zhuǎn)化子基因組中。 -7- 中國科技論文在線 215 圖 6 PCR 檢測轉(zhuǎn)化子中 hp

31、h Fig.6 Detection of hph gene in transformants by PCR amplification. M: Marker DL2000; CK: Y2021A;1-6: Transformants. 3 討論 原生質(zhì)體制備是 CaCl2-PEG 介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化禾谷鐮孢菌的關(guān)鍵，原生質(zhì)體的數(shù)量和質(zhì)量 220 更是影響轉(zhuǎn)化是否成功的兩大主要因素， 本研究發(fā)現(xiàn)用禾谷鐮孢菌幼殖體為酶解材料能夠制 備出足夠多的原生質(zhì)體， 比用菌絲體和分生孢子為酶解材料制備出的原生質(zhì)體量高出 1-2 個 數(shù)量級，而且用幼殖體為酶解材料制備的原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化效率可達到 40-50

32、個轉(zhuǎn) 化子/ g DNA 片段，這在真菌的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化中是比較高的轉(zhuǎn)化效率。本實驗室曾以 菌絲體為酶解材料制備原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化， 但其轉(zhuǎn)化效率較低， 這可能是因為菌絲的細胞壁 225 不易酶解而使其酶解不完全，得到的原生質(zhì)體吸收 DNA 的能力差而使轉(zhuǎn)化效率低。以幼殖 體為材料能夠制備出數(shù)量多質(zhì)量好的原生質(zhì)體， 因此， 幼殖體是制備禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體的 理想材料。本研究還確定了制備禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體的最佳酶組合、酶濃度、酶解時間、酶 解溫度和所用幼殖體的量。 原生質(zhì)遺傳轉(zhuǎn)化中所用原生質(zhì)體濃度要適宜。 實驗中發(fā)現(xiàn)， 轉(zhuǎn)化時所用原生質(zhì)體濃度高 230 于 108/mL 時，雖然能夠得到轉(zhuǎn)化子，

33、但轉(zhuǎn)化效率非常低；當(dāng)原生質(zhì)體濃度低于 106/mL 時， 幾乎得不到轉(zhuǎn)化子。禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化中所需原生質(zhì)體的合適濃度為 107/mL。 另外，轉(zhuǎn)化所用 DNA 的量不宜過多，轉(zhuǎn)化子的數(shù)量與轉(zhuǎn)化所用 DNA 的量并不成正比關(guān)系， 當(dāng) DNA 的量達到一定數(shù)值時，轉(zhuǎn)化子的數(shù)量不再增加，而是在一個很小的范圍內(nèi)波動，這 可能是因為一個含有一定量原生質(zhì)體的體系有一個固定的 DNA 吸收飽和值，因此，不是所 235 用 DNA 的量越多，轉(zhuǎn)化子的數(shù)量就越多。 目前， 有關(guān)禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體制備的報道中23,25， Novozyme 234 （InterSpex Products） 、 Drise

34、lase（Sigma）和 Chitinase（Sigma）這三種酶的混合酶解液能夠制備出質(zhì)量比較好的原 生質(zhì)體，但是 Novozyme 234（InterSpex Products）和 chitinase（Sigma）的價格非常昂貴。 本試驗用 driselase（Sigma）和 Smailase（北京百泰生化技術(shù)公司）的混合酶解液成功的制 240 備出能夠進行高效遺傳轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體， 對以上的酶系統(tǒng)進行了成功的替代。 經(jīng)濟高效的禾 谷鐮孢菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺的建立， 為建立禾谷鐮孢菌突變體文庫和研究其功能基 因提供的必要的技術(shù)支持。 參考文獻 (References 245 1 全國小

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