紅花黃色素對家兔缺血再灌注心肌超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡及bcl

1、KKME-專業(yè)醫(yī)學(xué)搜索引擎紅花黃色素對家兔缺血再灌注心肌超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡及bcl2、bax蛋白表達(dá)的影響作者：徐傳金 張文忠 馮培青 蔡尚郎 作者單位：青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東 青島 266003 【摘要】目的 通過在體兔心肌缺血再灌注模型，研究紅花黃色素對家兔缺血再灌注心肌超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡及bcl2、bax蛋白表達(dá)的影響。方法 24只新西蘭大白兔隨機分為3組：缺血再灌注組(IR組)，紅花黃色素組(SY組)，藥物組(MI組)，每組8只。實驗終末，取缺血壞死區(qū)心肌在光鏡、電鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡狀況，并且檢測bax和bcl2蛋白在心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果 與IR組相比，SY組能減輕

2、缺血心肌超微結(jié)構(gòu)的改變，并通過上調(diào)bcl2、下調(diào)bax表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)論 紅花黃色素能產(chǎn)生心肌保護作用，RISK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與了這一過程。 【關(guān)鍵詞】 紅花黃色素;缺血再灌注;細(xì)胞凋亡;bcl2;bax 紅花黃色素(safflower yellow,SY)是從紅花中提取的有效成分1，2，是臨床常用的活血化瘀藥物。現(xiàn)代藥理研究表明，紅花水煎劑能抑制血小板聚集，降低血液黏稠度3，其有效成分SY能延長凝血酶原時間和凝血酶時間4。SY具有提高心肌和血漿中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，加速自由基的清除等作用5。本實驗通過觀察SY對家兔缺血再灌注心肌超微結(jié)構(gòu)和凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響，驗證其對

3、心肌缺血的保護作用，并探討其可能的機制。 1 材料與方法 1.1 實驗動物和分組 健康新西蘭大白兔24只(購自河南醫(yī)科大學(xué)動物中心)，雌雄不分，體重2.02.5 kg，隨機分為3組，每組8只。缺血再灌注組(IR組)：結(jié)扎左冠狀動脈前降支1 h,再灌注6 h。SY組：于再灌注前10 min耳緣靜脈注射SY 10 mg/kg，余同IR組。藥物組(MI組)：于再灌注前5 min耳緣靜脈注射磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY294002(0.3 mg/kg)，余同SY組。 1.2 方法 1.2.1 心肌缺血再灌注模型制備 采用烏拉坦(1 g/kg)耳緣靜脈注射麻醉。仰臥位固定，心電圖導(dǎo)線與兔四肢相

4、連，記錄12導(dǎo)聯(lián)心電圖，連接心電監(jiān)護。除毛，沿胸骨正中偏左0.5 cm切開皮膚，暴露左側(cè)3、4肋骨，鈍性分離肋間肌，小彎鉗于肋下穿10號縫合線2根，分別結(jié)扎，沿結(jié)扎線正中剪斷3、4根肋軟骨;牽拉兩側(cè)結(jié)扎線，暴露胸腔，分離脂肪組織，可見心包及搏動之心臟。提起心包膜正中，用眼科剪將心包膜前部剪開,將心包膜用縫線固定于胸壁，充分暴露心臟。用止血鉗將左心耳輕輕提起，觀察冠脈的走行。以左冠狀動脈主干為標(biāo)志，在左心耳根部下方2 mm處，用持針器持小圓針在冠狀動脈前降支根部穿一結(jié)扎線，結(jié)扎線穿過心肌表層，在肺動脈圓錐旁穿出;在該結(jié)扎線下方約0.5 cm處再穿一結(jié)扎線，雙重結(jié)扎左前降支1 h，再灌注6 h。心

5、電圖胸前導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段弓背向上抬高為結(jié)扎成功。 1.2.2 心肌細(xì)胞光鏡學(xué)觀察 各組動物于再灌注末取缺血壞死區(qū)心肌組織行蘇木素伊紅(HE)染色，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。實驗步驟如下：取材固定脫水和透明透蠟包埋切片及貼附脫蠟復(fù)水染色水洗分化漂洗復(fù)染透明封藏，切片經(jīng)中性樹膠封藏，等樹膠干后就可在鏡下進(jìn)行觀察。 1.2.3 心肌細(xì)胞電鏡學(xué)觀察 各組動物于再灌注末取缺血壞死區(qū)心肌組織進(jìn)行超薄切片觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。實驗步驟如下：取材：取缺血再灌注區(qū)組織，制成1 mm3的組織塊;2.5%戊二醛4固定4 h;磷酸緩沖液(PBS)漂洗3次;1%鋨酸固定3 h;PBS漂洗3次;脫水;浸透：用二甲基酮與E

6、pon812包埋劑混合液(12)浸透;包埋：將樣品移到Epon812包埋劑中進(jìn)行包埋;超薄切片：用UltracutE超薄切片機進(jìn)行超薄切片，厚度為50100 nm，干燥后即可染色;染色：醋酸雙氧鈾染色15 min，蒸餾水徹底水洗3次;枸櫞酸鉛染色15 min，再用蒸餾水徹底水洗3次。切片干燥后即可置于電子顯微鏡(日本JEOL公司JEM1200EX透射電鏡)下觀察。 1.2.4 原位末端標(biāo)記凋亡細(xì)胞末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(Tunel法)檢測 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每張切片隨機選擇5個視野(400)，記錄陽性染色的心肌細(xì)胞數(shù)及心肌細(xì)胞總數(shù)，以凋亡細(xì)胞數(shù)

7、占心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比來確定凋亡指數(shù)(AI)。AI=Tunel陽性細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)100%。 1.2.5 心肌細(xì)胞中bcl2、bax蛋白表達(dá)的免疫組化(SP)法檢測 將取材中10%中性甲醛固定的標(biāo)本固定24 h后行常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度約4.5 m，貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。二甲苯和酒精脫蠟;3%過氧化氫孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS液沖洗;5%10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min;加入一抗：bcl2、bax均為1100稀釋后加入玻片中，4過夜，PBS液洗3次，每次5 min;加入二抗：滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37孵育30 min，PBS洗3次

8、，每次5 min。顯色：加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑510 min;HE復(fù)染2 min，脫水、透明、封片、鏡檢。每張切片隨機選取5個視野(400)采用VIDAS圖像分析系統(tǒng)(德國歐波同公司)測定其陽性表達(dá)面積、平均光密度和積分光密度，并采用公式：單位面積平均光密度=積分光密度/(512512)100% 進(jìn)行數(shù)據(jù)換算。 1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)均以xs表示,使用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析,組內(nèi)比較采用方差分析，兩組間比較采用q檢驗(Student NewmanKeuls法)。 2 結(jié) 果 2.1 光鏡學(xué)觀察 IR組心肌細(xì)胞間質(zhì)水腫，細(xì)胞界限不清，可見較多粒細(xì)胞灶狀浸潤，并可見少量

9、紅細(xì)胞滲漏。SY組心肌細(xì)胞輕度水腫，界限清楚，心肌細(xì)胞排列相對規(guī)則，見少量粒細(xì)胞浸潤，無紅細(xì)胞滲漏。MI組心肌細(xì)胞水腫嚴(yán)重，部分細(xì)胞溶解，細(xì)胞界限欠清楚，橫紋消失，可見較多粒細(xì)胞浸潤，并可見紅細(xì)胞滲漏。 2.2 電鏡下觀察 IR組心肌細(xì)胞水腫明顯;線粒體明顯腫脹，溢出到細(xì)胞外，嵴明顯減少，基質(zhì)中致密顆粒減少甚至消失，伴空泡樣形成;肌膜破壞，出現(xiàn)膜斷裂、缺損，肌原纖維模糊，部分Z線不明顯;細(xì)胞核腫脹，異染色質(zhì)增多，核不規(guī)則，甚至核碎裂。SY組超微結(jié)構(gòu)變化輕微，僅見心肌細(xì)胞內(nèi)輕度水腫;線粒體輕度腫脹，嵴部分消失;肌原纖維排列規(guī)則，肌小節(jié)清楚，僅見少量肌絲斷裂，Z線明顯，閏盤清晰;細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)分布均

10、勻，無核裂解及固縮現(xiàn)象。MI組細(xì)胞水腫明顯，胞膜固縮消失;線粒體彌漫性腫脹，;糖原減少，肌原纖維極度松弛、拉長，Z線扭曲、變形，肌絲橫斷、撕裂、溶解;核固縮，可見凋亡小體;間質(zhì)明顯水腫。 2.3 凋亡細(xì)胞Tunel檢測結(jié)果 IR組AI為21.373.86，SY組AI明顯降低(15.473.63)(P0.05)。 2.4 心肌細(xì)胞中bcl2、bax蛋白的表達(dá) bcl2陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿及胞膜呈棕褐色，bax陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿呈棕褐色。著深棕色者為強陽性表達(dá)細(xì)胞，不著色者為陰性表達(dá)細(xì)胞，介于兩者之間者為弱陽性表達(dá)細(xì)胞。各組心肌細(xì)胞bcl2、bax蛋白表達(dá)見表1。表1 各組心肌細(xì)胞AI、bcl2、b

11、ax蛋白表達(dá)(略) 3 討 論 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變是反映細(xì)胞損傷最直觀的指標(biāo),心肌缺血3040 min，心肌細(xì)胞可發(fā)生缺血性損害。光鏡下觀察見正常心肌細(xì)胞內(nèi)中性粒細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤等損傷。線粒體對缺血缺氧十分敏感,是決定細(xì)胞由可逆到不可逆改變的關(guān)鍵細(xì)胞器，線粒體彌漫性腫脹，膜破裂、嵴溶解、消失，基質(zhì)出現(xiàn)嗜鋨性顆粒等均是缺血造成的損傷。本研究發(fā)現(xiàn),SY可以減輕心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,從而對心肌產(chǎn)生保護作用。 細(xì)胞凋亡是機體的正常細(xì)胞在受到生理性或病理性刺激后啟動的自發(fā)死亡過程是缺血再灌注損傷發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)6。大多數(shù)細(xì)胞在凋亡過程中需要新基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成。bcl2基因是凋亡抑制

12、基因，其過量表達(dá)可阻斷因缺血、細(xì)胞因子短缺、輻射、抗腫瘤藥物、cmyc等不同刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。bcl2抑制凋亡的機制是它可直接或間接地阻止細(xì)胞色素C自線粒體的釋出，而后者可與ATP一起改變Apaf1的構(gòu)型而使caspase9激活。bax基因為促進(jìn)凋亡基因，主要表達(dá)于線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。bax與bcl2有很高的同源性，能與bcl2形成異源二聚體，通過抑制后者的活性，使凋亡易于發(fā)生。bcl2和bax的表達(dá)程度決定了細(xì)胞命運，bcl2占優(yōu)勢時阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生，而Bax占優(yōu)勢時細(xì)胞趨向凋亡7。本研究采用Tunel法、SP技術(shù)檢測了心肌細(xì)胞AI及bcl2、bax蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示各組均有一定的心肌

13、細(xì)胞凋亡，而SY組AI明顯較低，證實了SY可以減輕缺血再灌注損傷后的心肌細(xì)胞凋亡程度;同時發(fā)現(xiàn)SY組bcl2蛋白表達(dá)增強，而bax蛋白表達(dá)明顯減少，進(jìn)一步顯示，SY對缺血再灌注心肌凋亡相關(guān)基因的表達(dá)具有顯著的作用，即明顯上調(diào)bcl2的表達(dá)、下調(diào)bax的表達(dá)，從而發(fā)揮對心肌的靶保護作用。 目前認(rèn)為缺血預(yù)處理的機制是短暫的缺血再灌注使大量的內(nèi)源性物質(zhì)如腺苷、緩激肽、阿片等釋放7，然后作用于相應(yīng)的受體，誘導(dǎo)蛋白激酶C(PKC)的激活，再進(jìn)一步激活其他激酶，最終激活再灌注損傷補救酶(RISK)途徑，使效應(yīng)器磷酸化，效應(yīng)器可能主要是線粒體上的ATP敏感性鉀通道(mKATP)，誘導(dǎo)心肌保護機制8。PI3K

14、是RISK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成之一9。本研究通過應(yīng)用藥物PI3K抑制劑LY294002發(fā)現(xiàn)，該藥物能夠阻斷SY對心臟的保護作用，因此推測RISK參與了SY對心肌的保護作用,其具體機制尚待進(jìn)一步研究。 【參考文獻(xiàn)】 1 李中原，涂秀華.紅花黃色素的藥理研究進(jìn)展J.中藥新藥與臨床藥理，2005;16(2)：1536. 2 李 芳，孫明智.紅花黃色素對豚鼠心室乳頭肌缺氧和復(fù)氧損傷的保護作用J.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1999;33(1)：68. 3 顧紅璋.中藥紅花煎劑對血小板聚集功能的影響J.中國血液流變學(xué)雜志,1994;2:48. 4 黃正良，崔程梅，任 遠(yuǎn).紅花黃色素的抗凝血作用研究J.中成藥,19

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