糖化酶的生產(chǎn)流程設(shè)計方案

1、糖化酶的生產(chǎn)流程設(shè)計方案糖化酶即葡萄糖淀粉酶（1 ,4 - a葡聚糖葡聚糖水解酶，EC. 3. 2. 1. 3）是淀粉糖化工藝的主要酶類，被廣泛地應(yīng)用于 食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等工業(yè)。目前，糖化酶的生產(chǎn)菌種主要為 黑曲霉。根據(jù)使用的生產(chǎn)菌種不同及發(fā)酵工藝不同，工業(yè) 生產(chǎn)中，糖化酶的發(fā)酵生產(chǎn)水平在35 00（H55 OOOUPmL不等。 糖化酶的工業(yè)化生產(chǎn)從過去的固體發(fā)酵沿革到上世紀(jì)90年代初,液體發(fā)酵工藝逐步取代了原固體發(fā)酵工藝。液體發(fā)酵 工藝的建立與應(yīng)用極大地改善了發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量并大幅度提升 了糖化酶的發(fā)酵生產(chǎn)水平。但現(xiàn)有糖化酶發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)共同 存在不足之處，其中種子制備周期和發(fā)酵生產(chǎn)周期很長是一

2、個較突出的問題，如實驗室的種子制備需要15d以上,發(fā)酵周 期通常200h以上。生產(chǎn)流程圖試驗菌種的分純1、培養(yǎng)基（1）固體培養(yǎng)基，察氏培養(yǎng)基 +1 酵母膏 +1 蛋白胨；（ 2）初篩 培養(yǎng)基，玉米粉：麩皮：米糠：硫酸胺 =7:3:2:0.16 （ 3）誘變后 培養(yǎng)基，玉米粉：麩皮：米糠：硫酸胺=8：3:1.5:2:0.1，6 水 80ml。（2）原料：玉米粉、麩皮等（3）菌種分純將麩皮采集菌種取出一部分， 置入裝有 10mL 生理鹽水和若干玻 璃珠的小三角瓶內(nèi)，振蕩 15 分鐘，將上清液一次稀釋成 10-1、10-2、 103,各取0.1mL做平板劃線，29C培養(yǎng)56天，分別挑取單個菌落 接入

3、斜面，29C培養(yǎng)一周。以大連某廠的生產(chǎn)用菌 B-11 為對照，對分離菌株做搖床發(fā)酵試 驗， 96h 后測定糖化力，配合鏡檢，確定誘變的出發(fā)菌株。二、試驗菌株的誘變用生理鹽水洗下成熟出發(fā)株的孢子、 倒入 5mL 麥汁種 1酵母 膏的三角瓶中，振蕩1.5h,使孢子活化，后 3500r/min.離心分離15 分鐘，用 pH7.2 磷酸緩沖液洗滌一次，再用緩沖液 5ML 洗轉(zhuǎn)入小三 角瓶內(nèi)（內(nèi)有數(shù)枚無菌玻璃珠），振蕩 10 分鐘，使孢子分散均勻， 過濾，制成單孢子懸浮液，將濃度調(diào)至 106個/ml取10ml孢子懸浮液于9cm平板中，紫外線（UV）照射誘變2 分鐘（避光操作），紫外線動率15W,室溫，攪

4、拌，照射距離30cm向經(jīng)紫外線處理的菌液中加入硫酸二乙酯（DES）稀液（原液1ml, 95%乙醇4ml配制）0.1ml, 32C恒溫處理15分鐘，不斷搖動平皿，處理后立即稀釋至 10-2、10-3（中止反應(yīng)），各取 0.10.2ml 涂平 板，29C培養(yǎng)5天后挑取單菌接入試管。搖床發(fā)酵試驗，優(yōu)選出糖化力高的新菌株 UD-7 等。三、糖化酶的制備（一）材料：菌種：黑曲霉 儀器：恒溫培養(yǎng)箱離心機水浴鍋恒溫液體振蕩 培養(yǎng)器小型液體發(fā)酵罐分光光度計等 試劑：鏈霉素 0 1苯甲酸鈉乳酸氫氧化鈉硫酸 銨等（二）設(shè)備LRH-250 型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司； TGL-16C 型臺式高速離心機 上海

5、安亭科學(xué)儀器廠； 1086型精密水浴鍋 德國GFL公司；HYG-II型迴轉(zhuǎn)式恒 溫調(diào)速搖瓶機 上海新星自動化控制設(shè)備成套廠； UV- 2100 型紫外分光光度計 UNICO（ 上海）儀器公司； LS- 350L 型立式壓力蒸氣滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠； MP2000D 型電子天平 精科儀器 （上海 ）有限公司； DG- 2B 多功能恒溫箱 上海醫(yī)療器械修造廠；超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司。（三）方法液體深層發(fā)酵工藝流程：試管斜面菌種一種子擴大培養(yǎng)一液體深 層通風(fēng)發(fā)酵一過濾一離心一干燥一粗酶制劑一酶活測定 配方：斜面種子培養(yǎng)基：蔗糖30g硫酸銨3g磷酸 氫鉀lg硫酸鎂0. 5g硫酸鐵0. Ol

6、g水1000m晾脂2% 液體搖瓶擴大培養(yǎng)基：玉米面 4。豆餅粉 3 麥麩 1% Kel O . 5g水 lO00ml 自然 PI-I 通風(fēng) 恒溫液體深層通風(fēng)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉 10% 豆餅 粉4% 麥麩l% 水1000ml PH4. 51 粗酶提取 發(fā)酵液一過濾一鹽析一固形物一烘干一加入淀粉添 充劑一磨粉一粗酶制劑。2酶活力測定 酶活力測定方法（一）鋼圈法： 5ml 3% 晾脂倒皿一再加 5ml 可溶性淀粉與 3% 晾脂一放入三個滅過菌的鋼圈分 別滴人不同濃度的酶液一定期測定透明圈直徑。（二）比色法：lOml 20%可溶性淀粉5ml檸 檬酸PH4. 8 （對照不加酶液。處理加lm1）加Iml1

7、0% NaOH終止反應(yīng)，對照補加Iml酶液一濾紙過渡一 比色。四、結(jié)果 與分析（一）結(jié)果1.鋼圈實驗結(jié)果如下表:播化翡鋼錮測試時間緒號Lem2 cm3cm平均值23日肌101號(A%)1.365L.3651340135723 td«r in2號（稀釋1倍！1320】湘1.270i.xa23 93號L170Ll«51.16723 K11： JOI號（原腴）1.4555).4751.475146323 *lh 102 號13401.3S01.3801033523 口U； 1G3號（棒釋2僭1,3151.365L3251.33523 H16± 001（原液）1.4601

8、.5251.500149S23日16： CO2號（稀驛1信）1.3651370I3«51 37123 H003( 釋1,2201.2551.24524日301 號1J60r?05IJM)1.70224 U也302 號1.3751.470L4fl01.41224日8； 3C3號（稀釋2依）13001.35013251 3262. DNS測定結(jié)果如下表皿化蜀酶活測定'反應(yīng)時間CK處理CK處理比色原應(yīng)Ehr10 min0.0940.250.4801.2190.738US50.230min0.04)03380.229LO51.40621時47.W平溝49（二）分析用液體深層發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶，由于黑曲霉具很強的抗污染力，生產(chǎn)力 強，易培養(yǎng)，所以菌種培養(yǎng)條件一般很好控制，不會受到污染，而發(fā) 酵條件難以控制。這正是提高酶活的關(guān)鍵。據(jù)中科院研究認為，酶的 形成時刻與培養(yǎng)時間無關(guān)，而與培養(yǎng)基的 PH變化有關(guān)，只有當(dāng)PH從3. 0回升時才能開始檢測出酶活力，PH回升到4. 5以后酶開始大量 形成。五、包裝與保存（一）保存將用容器裝好的食品級糖化酶放入鈷源輻照室的某一位