紅霉素生產(chǎn)工藝

1、畢業(yè)論文題 目：淺談紅霉素發(fā)酵工藝系 部： 生物工程系專 業(yè)：生物技術及應用班 級：姓 名：學 號：指導教師：2012 年4月 10日摘要61前言£1. 1簡述61.2物化性狀61.3作用機理61.4紅雰素發(fā)酵的研究意義61.5紅霉素研究現(xiàn)狀71.6現(xiàn)階段的研究方向-72紅霉素發(fā)酵工藝流程及操作要點-72. 1發(fā)酵工藝流程72. 1. 1 一級發(fā)酵工藝72. 1.2二級發(fā)酵工藝82. 1.3三級發(fā)酵工藝-82.2紅霉素發(fā)酵操作要點£2. 2.1紅霉素發(fā)酵營養(yǎng)組分勺2. 2. 1. 1碳源營養(yǎng)*92. 2. 1.2氮源營養(yǎng)102. 2. 2紅霉素發(fā)酵操作注意事項112. 2.

2、 2. 1紅霉素發(fā)酵PH控制-112. 2. 2. 2紅霉素發(fā)酵豆油的控制112. 2. 2. 3紅霉素發(fā)酵溫度的控制122. 2. 2. 4紅霉素發(fā)酵溶氧的控制122. 2. 2. 5紅霉素發(fā)酵空氣的控制122. 2. 2. 6發(fā)酵液質量控制132. 2. 3有效成分測定標準133結論13參考文獻14 15摘要紅雰素是20世紀50年代開始生產(chǎn)的大環(huán)酯類抗生素，他的抗菌譜與青霉素G相 似，只要用于抗革蘭氏陽性菌所致的感染，對青霉素耐藥菌和某些病原體如軍團菌、 螺桿菌、支原體、衣原體、放線菌、非結核分枝桿菌、立克次體及某些厭氧菌感染有 效。紅霉素還具有改善機體免疫系統(tǒng)的作用，對不斷增加的許多致病

3、微生物也有良好 的抗菌活性。隨著對紅霉素的研究開發(fā)深入開展，一些高效、長效、生物利用度好、 各具特色的新紅雰素半合成衍生物具有很大的市場潛力。本次研究對紅雰素的發(fā)酵條件進行了簡要的探討，其中紅雰素的發(fā)酵單位達XXX, 相當于目前國紅霉素的生產(chǎn)有了一定的突破和進展，對紅霉素的工藝研究具有一定了 理論指導意義及重大的經(jīng)濟價值。關鍵字：紅霉素；發(fā)酵工藝參數(shù)；探討1.1簡述紅雰素是由紅雰素錢雰菌(Streptomyces erythreus)所產(chǎn)生的大環(huán)酯(macrolide) 系的代表性的抗菌素?？梢砸种萍毦鞍踪|的合成，系抑菌劑，其中主要對革蘭氏陽 性菌、立克次氏體等具有抗菌活性，是治療耐藥性金黃

4、色葡萄球菌感染和溶血性鏈球 菌感染所引起疾病的首選藥物。隨著紅霉素衍生物藥物的不斷涌現(xiàn)，對紅霉素的認識 提升到了新的層面，如何提髙紅霉素發(fā)酵單位成為近來研究開發(fā)的熱點?，F(xiàn)階段，我 國紅雰素年產(chǎn)量與國際水平相差較大美國亞培公司年產(chǎn)量達2000t,我國僅200t (馬 培齊.醫(yī)藥經(jīng)濟信息，203:15.),國外的發(fā)酵單位也髙達8000-12000u/ml(馬培齊.醫(yī) 藥經(jīng)濟信息,203:15.)。1.2物化性狀紅霉素分子式GHEIOe分子量733.93 , 熔點138-14(TC,為白色或類白色 的結晶或粉末；無臭，味苦；微有引濕性，易溶于乙醇和丙酮，微溶于水，是-種堿性 抗生素。是發(fā)酵過程中產(chǎn)生

5、的次級代產(chǎn)物，主要活性成分是紅寡素A,雜質組分主要有 紅雰素B、紅霉素C、紅霉素D、紅霉素E以及紅霉素F等。其中主要雜質為紅霉素C。13作用機理主要對革蘭氏陽性菌具有抗菌性。LD50為200-400毫克/公斤，與細菌的聚核糖 體結合而抑制肽鏈的延伸，從而抑制細菌蛋白質的合成。1.4紅霉素發(fā)酵的研究意義紅毒素屬大環(huán)酯類抗生素，具有廣譜抗菌作用，其抗菌譜與青霉素相似，對革蘭 氏陽性菌尤其敏感。臨床主要用于扁桃體炎、猩紅熱、白喉、淋病腸道阿米巴病、皮 膚軟組織感染等的治療。上、下呼吸道感染也可選用紅雰素。需要特別指出的是，紅 雰素對于不能耐受青霉素的患者也適用。紅霉素除被收入中國藥典外，還被收入 美

6、國、英國、日本等許多國家的藥典中。近年來，在競爭激烈的抗生素市場上，紅雰 素及其衍生物產(chǎn)量逐年增長，銷售額不斷上升，預計今后的市場仍有廣闊的發(fā)展空間。15紅霉素研究現(xiàn)狀現(xiàn)階段，我國紅霉素年產(chǎn)量與國際水平相差較大美國亞培公司年產(chǎn)量達2000t,我 國僅2001 （馬培齊.醫(yī)藥經(jīng)濟信息，203： 15.）,國外的發(fā)酵單位也髙達 8000-12000u/ml （馬培齊.醫(yī)藥經(jīng)濟信息，203:15.）。1.6現(xiàn)階段的研究方向通過控制優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵過程中溶氧、PH、空氣量、攪拌轉速、罐壓、補料等 來提高紅雰素A的含量，從而提高紅雰素的產(chǎn)量。2紅霉素發(fā)酵工藝流程及操作要點2. 1發(fā)酵工藝流程一級發(fā)酵工藝

7、一級培養(yǎng)基配方：打入軟化水200L、豆餅粉8.75kg、玉米淀粉10.76kg、糊精 9.30kg、玉米漿 4.65kg、鹽 2.43kg、硫酸鐵 1.23kg、豆油 4.25kg、消泡劑 0.16kg, 用液堿調PH至6.2 （±0. 1）,加入CaCOa 3.45kg,再打軟化水至400L。初始條件：溫度34.09灌壓0. 05Mpa轉速80rpm通氣量0. 8vvm溶氧100%當溶氧低于40%時，釆用轉速和空氣流量交替上升的方式來提高溶氧，轉速每次 提高10轉。轉速通氣量轉速通氣量轉速通氣量轉速通氣量80 1200.91201601.01602001. 12002401.2 1

8、.5移種標準：當PH先上升（第一個高峰），再下降，再上升后當?shù)谌齻€高峰出現(xiàn)后（第四個高峰），向后推46小時開始移種，需要推遲移種時間時，溫度可以降至32* 降速為0. 5°C / ho2. 1.2二級發(fā)酵工藝初始條件：溫度33. 0°C灌壓0. 05Mpa轉速70rpm通氣量l.Ovvm溶氧100% 當溶氧低于40%時，采用轉速和空氣流量交替上升的方式來提高溶氧，轉速每次提髙5轉。轉速通氣量轉速通氣量轉速通氣量轉速通氣量70 851. 1585 1051.21051201.351201351. 41. 55移種條件：移種發(fā)酵罐時，條件是當PH先上升（第一個高峰），在下降，在

9、上升 后當高峰出現(xiàn)后（第二個高峰），向后推46小時開始移種，或第一個髙峰向后推14 個小時。需要推遲移種時間時，溫度可以降至33*降速為0.5£/h。2. 1.3三級發(fā)酵工藝初始條件：溫度32. 5°C灌壓0. 05Mpa轉速50rpm通氣量0. 55vvm溶氧100% PH 7. 0 左右。發(fā)酵過程中溶氧的控制：接種后，溶氧從100%開始下降，隨著菌體的生長，溶 氧低于45%時，采用轉速和空氣流量交替上升的方式來提高溶氧，轉速每次提髙5轉， 具體參照下表，表中條件從左至右，從上至下逐條使用，當表中條件用完后，溶氧仍 低于45%時，（溶氧低于15%時）開始補水，補速1200

10、L/ho 中后期，溶氧逐步回 升，當期高于50%,按照如下方法，將溶氧控制在45%,具體參照下表，表中條件從 左至右逐條使用，轉速每次降低5轉，溫度每次降低0.3°Co罐壓0. 05溫度32.5通 氣量1.0轉速逐漸降低，每次降低5轉。轉速通氣量轉速通氣量轉速通氣量轉速50 600.660 700. 6570 800. 780 90通氣量轉速溫度通氣量罐壓補水0.890 100331.00. 061200三、發(fā)酵中PH控制接種后PH先下降后上升，然后再次下降，當PH降至6.90以下時，開始用糖調 節(jié)PH, PH自控維持在6. 90o一、發(fā)酵中補糖控制當PH上升至7.257. 45長時

11、間沒有下降時（22.5h）,開始補糖，起始速度為200L/h,使PH緩慢降到6. 87.0,當PH<6. 90時，停止補糖，當PH回升到>6. 90 時，開始進行自控，將PH控制在6. 90液糖濃度（30%）左右。五、發(fā)酵中正丙醇的控制發(fā)酵20h左右開始補正丙醇，開始正丙醇的殘留量控制在0. 51. 5g / L,40- 130h 控制在1.52.5g/L正丙醇濃度(30%)左右。正丙醇35周期后具體加量根據(jù)殘留量 來定。周期(h)20 3536 5454放罐正丙醇(L/h)24 4646 9294 144二、發(fā)酵中豆油的控制發(fā)酵25h左右開始補豆油，在45120h,豆油的補速按照

12、表中的高限來補，其 余時間當豆油的殘留量為0時，補速提高10%具體參照下表。周期(h)25 3536 132132放罐豆油(L/h)30 4056 8868 122豆油在55周期后具體加量根據(jù)殘留量來定。六、放罐條件：生物量在35%左右，粘度到(180cp)左右，鏡檢菌絲有自溶現(xiàn)象發(fā) 生，周期在189h左右，效價9000 u /ml,溶氧一直上升而沒有下降趨勢。2. 2紅霉素發(fā)酵操作要點2. 2.1紅霉素發(fā)酵營養(yǎng)組分碳源營養(yǎng)碳在細胞中的干物質中約占50%,所以微生物對碳的需求最大。凡是作為微生物細 胞結構或代產(chǎn)物中碳架來源的營養(yǎng)物質，都稱為碳源。其作用一方面是作為微生物細胞 結構或代產(chǎn)物中碳架

13、來源，另一方面是提供菌體生長，產(chǎn)物分泌所需要的能量。作為微 生物營養(yǎng)的碳源物質種類很多，從簡單的無機物(CO“碳酸鹽)到復雜的有機含碳化合 物(糖、糖的衍生物、脂類、醇類、有機酸、芳香化合物及各種含碳化合物等)都可作 為碳源。根據(jù)碳素的來源不同，可將碳源物質分為無機碳源物質和有機碳源物質兩類。 發(fā)酵中使用的碳源物質通常是各種有機碳源物質。葡萄糖(液糖)：紅雰素采用流加液糖方式，其作用在于調節(jié)發(fā)酵液的pH,另一方面作為碳源之一。多糖工業(yè)發(fā)酵用的多糖：有糊精、淀粉及其水解液。玉米淀粉及其水解液是抗生素、氨基酸、核昔酸、酶制劑等發(fā)酵中常用的碳源。玉米淀粉：糊精英文名稱：dextrin；amylin定

14、義：淀粉經(jīng)酶法或化學方法水解得到的降解產(chǎn) 物，為數(shù)個至數(shù)十個葡萄糖單位的寡糖和聚糖的混合物。包括有麥芽糖糊精、極限糊精 等。糊精通常分為三類：白糊精、黃糊精和英國膠或稱“不列顛膠"。它們之間的差異在 于對淀粉的預處理方法及熱處理條件不同。脂類（豆油）：雰菌和放線菌可利用油脂做碳源。在發(fā)酵過程中，加入油脂有消泡和補充碳源的雙 重作用。在紅雰素的生產(chǎn)當中，豆油是原料之一，其作用一方面是消泡，另一方面可以被鏈 雰菌利用作為碳源，提供合成紅雰素的前體。有機酸、醇：正丙醇：正丙醇是原料之一，作為合成紅霉素的前體，其也可被鏈雰菌菌利用作為 碳源。氮源營養(yǎng)氮元素是微生物細胞蛋白和核酸的主要成分，對

15、微生物的生長發(fā)育有特別重要的意 義。因此我們可以將氮源分為無機氮源和有機氮源兩種，兩者在發(fā)酵中都有應用。（1）無機氮源常見的無機氮源主要包括氨水、鐵鹽等。無機氮源的利用速度一般比有機氮源快， 因此無機氮源又被稱作速效氮源。某些無機氮源由于微生物分解和選擇性吸收的原因， 其利用會逐漸造成環(huán)境pH的改變。例如：在紅霉素生產(chǎn)中，在基礎料中加入硫酸鐵的方式補充無機氮源，在部分文獻中也采用間 接流加硫酸鐵的方式來補充無機氮源。無機氮源雖然價格便宜、利用迅速，但是并非所有的微生物都能利用這類簡單的氮 源。（2）有機氮源有機氮源是另一大類發(fā)酵氮源，主要是各種成分復雜的工農業(yè)下腳料，種類非常多， 如玉米漿、各

16、種豆粉、玉米粉、實驗室常用的牛肉膏、蛋白牒等等。總的來說，微生物在有機氮源培養(yǎng)基上生長要比無機氮源培養(yǎng)基上旺盛，這主要是 由于有機氮源的成分一般比較復雜，營養(yǎng)也較無機氮源豐富。有機氮源中除含有一定比 例的蛋白質、多肽及游離氨基酸以外，還含有少量的糖類、脂類以及各種無機鹽、維生 素、堿基等。由于微生物可以直接從培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)成分，所以微生物在有機氮源 上的生長一般較好，更有一些微生物必須依賴有機氮源提供的營養(yǎng)才能生長。黃豆餅粉是發(fā)酵工業(yè)最常用的有機氮源。根據(jù)油脂含量可將其分為三種，全脂黃豆 粉（含油脂18%以上），低脂黃豆粉（含油脂9%以下），脫脂黃豆粉含油脂2%以下）蛋白 膵、酵母粉等使

17、工業(yè)上常用的有機氮源。2. 2. 2紅霉素發(fā)酵操作注意事項2. 2. 2.1紅霉素發(fā)酵PH控制對pH的要求視不同菌種而異，一般為6. 4-6. 8,紅雰素發(fā)酵的最適PH值一般認為 在6. 95左右，有時也可以略高或略低一些，但應盡量避免pH值超過7.0,因為紅雰素 在堿性條件下不穩(wěn)定，容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中，pH值的變化是 葡萄糖流加速度高低的反映。過高的流加速率會造成酸性中間產(chǎn)物的積累，以至于pH 值降低；過低的加糖速率不足以中和蛋白質代產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質代產(chǎn)生的 堿性化合物而引起pH值上升。加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵中的pH值確定，最 好是根據(jù)CER、OUR、

18、RQ及KLA來控制，一般在殘?zhí)橇拷抵?. 6%左右，pH值上升時開 始加糖。2. 2. 2. 2紅莓素發(fā)酵豆油的控制發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫，可以用天然油脂如豆油，玉米油或用化學合成消泡劑 “泡敵”來消泡，應當控制其用量并要少量多次加入，避免出現(xiàn)DO低谷，尤其在發(fā)酵 前期不易多用，否則會影響菌體的呼吸代即體現(xiàn)在DO上.在好氧性發(fā)酵中泡沫的存在 可以增加氣液接觸面積，增加氧的KLAo但當發(fā)酵旺盛時也會因產(chǎn)生大量泡沫而引起逃 液，給發(fā)酵造成困難，帶來不利因素，防礙了氧氣的溶解，造成代異常；增加污染雜 菌的機會，導致產(chǎn)物的損失；而且在發(fā)酵過程中泡沫的消長規(guī)律為：初期易產(chǎn)生泡沫， 但一般易碎，中期產(chǎn)生泡

19、沬較少，后期大量產(chǎn)生泡沫，且不易破碎。因而在發(fā)酵生產(chǎn) 中（提高罐壓，降低通氣量短時間間歇性停止攪拌都可減少泡沫的影響）加入適量的 玉米油，控制在一定圍。采用少量多次的加入。發(fā)酵期間應盡量不加油類消沫劑以免 菌體代能力下降。（機械消泡的優(yōu)點為不引入外界物質，不增加培養(yǎng)液的復雜程度，不 影響產(chǎn)物的提??；缺點則為不能從根本上消除泡沫穩(wěn)定的因素，僅適用于泡沫產(chǎn)生較 少較易破碎時.2. 2. 2. 3紅霉素發(fā)酵溫度的控制前期32.5*,后期28.59,以減少后期發(fā)酵液中紅霉素的降解破壞。紅霉素發(fā)酵 的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別，但一般認為應在32.59左右，溫度過髙 將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率，同時增

20、加葡萄糖的維持消耗，降低葡萄糖至紅雰素的轉化率。 對菌絲生長和紅毒素合成來說，最適溫度不是一樣的，一般前者略高于后者，故有的 發(fā)酵過程在紅雰素生長階段采用較高的溫度，以縮短生長時間，到達生產(chǎn)階段后使適 當降低溫度，以利于紅雰素的合成。2. 2. 2. 4紅霉素發(fā)酵溶氧的控制溶氧控制一般不低于45%,通風比一般1:0. 8vvm攪拌轉速在發(fā)酵各階段應根據(jù)需 要而調整。對于好氧的紅霉素發(fā)酵來說，溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個重要因素。 當溶氧濃度降到45%飽和度以下時，紅霉素產(chǎn)率急劇下降，低于5%飽和度時，則造成 不可逆的損害。溶氧濃度過高，說明菌絲生長不良或加糖率過低，造成呼吸強度下降, 同樣影響

21、生產(chǎn)能力的發(fā)揮。溶氧濃度是CER和0UR的一個動態(tài)平衡點，使RQ控制在0. 9 左右，而氧消耗與碳能源消耗成正比，故溶氧濃度也可作為葡萄糖流加控制的一個參 考指標。2. 2. 2. 5紅霉素發(fā)酵空氣的控制發(fā)酵車間使用的無菌空氣，是經(jīng)過空氣壓縮機吸入大氣中的空氣，壓縮，冷卻， 除慮后達到無菌空氣級別，才能被發(fā)酵車間使用。我們知道，被吸入的空氣是非常不 潔凈的，僅以0.5um的塵埃就多達180000-260000粒兒，要把這樣級別的空氣凈化到 無菌級別（0.5um=3.5粒兒），這幾十萬數(shù)量級的差異，要多級除慮。我們高效膜過濾 系統(tǒng)采用三級除慮的設備流程，目的就是保護高效膜濾芯，延長各級濾芯使用壽命， 以便更合理的達到無菌空氣凈化要求。無菌空氣三級除慮的要求分別是：初效過濾要 求將l-10um的塵埃除慮，攔截率100%,中效過濾要求將lum的塵埃除慮100%,高效 過濾要求將0. 3um的塵埃除慮100%。2. 2. 2. 6發(fā)酵液質量控制生產(chǎn)上按規(guī)定時間從發(fā)酵罐中取樣，用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化，來控制發(fā)酵， 生產(chǎn)上慣稱鏡檢，根據(jù)鏡檢中菌絲形態(tài)變化和代變化的其他指標調節(jié)發(fā)酵溫度，通過 追加唐或補加前體等各種措施來延長發(fā)酵時間，以獲得最多紅霉素。當菌絲中空泡擴 大，增多及延伸，并發(fā)現(xiàn)個別自溶細胞，這表示菌絲趨向衰老，紅霉素分泌逐漸停止, 菌