重復(fù)水高壓注射介導(dǎo)hHGF 表達(dá)載體在小鼠體內(nèi)的持續(xù)高效表達(dá)

1、重復(fù)水高壓注射介導(dǎo)hHGF 表達(dá)載體在小鼠體內(nèi)的持續(xù)高效表達(dá)重復(fù)水高壓注射介導(dǎo)hHGF 表達(dá)載體在小鼠體內(nèi)的持續(xù)高效表達(dá)朱傳龍,李毓雯,高人燾,李宜,聶青和 作者單位：230001 合肥市安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院感染病科（朱傳龍，高人燾，李宜）；兒科（李毓雯）；西安市第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染病科、全軍感染病診療中心（聶青和）【摘要】目的構(gòu)建hHGF 表達(dá)載體并通過(guò)水高壓注射法研究hHGF 在小鼠體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)。方法從慢性乙型肝炎患者肝組織提取總RNA，RT-PCR 擴(kuò)增出hHGF 基因的cDNA 片段，將目的片斷克隆至pMD18-T 載體，酶切和測(cè)序鑒定，然后將目的片斷酶切回收后插入pcD

2、NA3.1 質(zhì)粒，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-hHGF，通過(guò)重復(fù)水高壓注射法將pcDNAhHGF 導(dǎo)入小鼠肝臟，并在首次水高壓注射后第0、3、6、9、12、15、18 和21 天分別收集小鼠血清和肝組織，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)hHGF 在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果擴(kuò)增出了長(zhǎng)約2187bp 的基因片段，并將其克隆至pMD18-T 載體，酶切和測(cè)序鑒定無(wú)誤；將pMD-hHGF 中hHGF 基因亞克隆至pcDNA3.0 載體，酶切鑒定無(wú)誤；首次水高壓注射后不同時(shí)間檢測(cè)外周血和肝臟均有hHGF 的高水平表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建了hHGF 真核表達(dá)載體pCMV-hHGF，重復(fù)水高壓注射法可將該基因?qū)?/p>

3、小鼠肝臟并獲得持續(xù)高效的表達(dá)。【關(guān)鍵詞】促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；肝臟；水高壓注射；基因表達(dá)；小鼠Sustained and high expression of human hepatocyte growth factor in mice following repeated hydrodynamicinjections of nakedplasmid ZHU Chuanlong，LI Yuwen，Gao Rentao，et al. Department of Infectious Disease，AffiliatedProvincial Hospital，Anhui MedicalUniversi

4、ty，Hefei 230001，China【Abstract 】Objective To construct human hepatocyte growth factor expression vector （pCMV-hHGF） and charac terize the expression of pMD-hHGF in vivo by repeated hydrodynamic injections in mice. Methods Total RNA was ex tracted from liver tissue of a patient with chronic hepaitisB

5、，cDNA was obtained by reverse transcription，hHGF cDNAwas amplified and cloned into pMD18-T vector and the sequences were identified by retriction endonucleases and sequencing assay. hHGF gene was dissected from pMD-hHGF and recloned into pcDNA3.0. pCMV-hHGF was analyzed by restriction endonucleases

6、to ensure the orientation. After the plasmid was transfected into mouse livers by repeated hydro dynamic injections，we collected plasma and livers of mouse at day0，3，6，9，12，15，18 and 21 after the first hydrodynam ic injection，and then detected the expression of hHGF by ELISA. Rusults A 2187bp gene f

7、ragment was obtained andcoloned into pMD18-T vector，and the sequence was correct. hHGF gene was subcloned into pcDNA3.0 vector，and thenrestriction endonucleases assays showed the correct orientation. The level of hHGF expression could be detected by enzyme linked immunosorbent assay after the first

8、hydrodynamic injection. Conclusion hHGF expression vector （pCMVhHGF）has been successfully constructed and repeated hydrodynamic injections can promote sustained and high expressionof hHGF in mice.【Key words 】Hepatocyte growth factor；Hydrodynamic injections；Gene expression；Mice肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte grow

9、th factor，HGF）又種多功能生長(zhǎng)因子。HGF 具有很強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增稱(chēng)擴(kuò)散因子（scatter factor，SF），是由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一殖和促血管生成作用，同時(shí)還能抑制細(xì)胞凋亡和減輕組織纖維化，已經(jīng)在治療肝纖維化及肝衰竭等疾病中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景1耀3。本研究構(gòu)建了人hHGF 真核表達(dá)載體pCMV-hHGF，并通過(guò)重復(fù)水高壓注射法將該質(zhì)粒導(dǎo)入正常小鼠肝臟，獲得hHGF 在小鼠體內(nèi)的持續(xù)高效表達(dá)，為進(jìn)一步開(kāi)展針對(duì)肝臟疾病的基因治療研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)Balbc/J 小鼠80 只，雌雄各半，6耀8 周齡，體質(zhì)量18耀20g，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中

10、心。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組40 只。二、主要儀器與試劑美國(guó)Beckman-Coulter 公司Allegra21R 低溫離心機(jī)，上海安章TGL-16G 臺(tái)式普通離心機(jī)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司DK-8D 型電熱恒溫水槽，德國(guó)Biometra 公司T3 Thermocycler PCR 儀。pcD 原NA3.0 購(gòu)自Invitrogen 公司，pMD18T 載體購(gòu)自大連寶生物公司。PCR 擴(kuò)增所用引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。TaqDNA 聚合酶購(gòu)自MBI Fermentas 公司，DNAMarker DL2000 購(gòu)自大連寶生物公司，DNA 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mi

11、ga 公司，限制性?xún)?nèi)切酶BamH 玉和Xba玉購(gòu)自大連寶生物公司，T4 DNA 連接酶購(gòu)自Promega 公司，感受態(tài)JM109 大腸桿菌購(gòu)自大連寶生物公司，hHGF ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)ADL 公司。三、水高壓注射（hydrodynamic injection） 按小鼠體質(zhì)量的10%計(jì)算質(zhì)粒注射溶液的體積，20g 的小鼠注射液為2 mL，將100滋g 的pCMV-hHGF 或pcDNA3.0 對(duì)照質(zhì)粒溶入2 mL 復(fù)方NaCl 溶液中，并于5耀7 秒內(nèi)將此溶液經(jīng)小鼠尾靜脈快速推入體內(nèi)。在首次注射后，每3 天用同樣的方法重復(fù)注射一次，總共注射7 次；對(duì)照組用pcDNA3.0 空載體注射。

12、四、hHGF 的表達(dá)分別于首次水高壓注射后第0、3、6、9、12、15、18 和21 天處死實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠5 只，并取外周血與肝組織置-80 益保存。血清經(jīng)分離后按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟采用ELISA 法檢測(cè)hHGF 水平； 肝組織經(jīng)勻漿后，加細(xì)胞裂解液，離心后取上清，通過(guò)考馬斯亮蘭行總蛋白定量，并檢測(cè)hHGF 水平，計(jì)算每mg肝組織總蛋白中hHGF 的含量（ng）。五、重組質(zhì)粒的構(gòu)建、克隆及鑒定取慢性乙型肝炎患者肝組織10 mg，按Trizol 試劑說(shuō)明書(shū)操作提取組織總RNA，以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到肝組織細(xì)胞的總cDNA 。以肝組織細(xì)胞cDNA 為模板，用hHGF 引物（上游引物

13、為5-ATTGGATCCATGGCGCCCTTTGCATCTCTG-3引入BamH 玉酶切位點(diǎn)，下游引物為5-CGCGTCTAGAC ，TATGACTGTGGTACCTTAT-3，引入Xba玉酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增hHGF 的全長(zhǎng)cDNA，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，連接于pMD18T 載體，將重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109 大腸桿菌，篩選出陽(yáng)性克隆。用限制性?xún)?nèi)切酶圖譜分析和DNA 測(cè)序（Invitrogen 公司）對(duì)重組體進(jìn)行鑒定。序列無(wú)誤后，對(duì)重組體pMD-hHGF 進(jìn)行BamH 玉和Xba 玉雙酶切，分離并純化小片段hHGF，連接于同樣經(jīng)過(guò)BamH 玉和Xba玉雙酶切并純化的大片段pcD

14、NA3.0，將重組體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)JM109 大腸桿菌內(nèi)，篩選出陽(yáng)性克隆。用限制性?xún)?nèi)切酶圖譜分析pCMV-hHGF 。六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析測(cè)定結(jié)果以均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差（x依s）表示，采用SPSS13.0 軟件包進(jìn)行t 檢驗(yàn)，P約0.05 為有顯著性差異。結(jié)果一、重組質(zhì)粒pCMV-hHGF 的構(gòu)建用經(jīng)典分子克隆方法，首先設(shè)計(jì)合成引物，以慢性乙型肝炎患者肝組織總cDNA 為模板經(jīng)PCR 擴(kuò)增HGF，然后通過(guò)T-A 連接插入到T 載體中，酶切鑒定正確后，進(jìn)一步測(cè)序證實(shí)與Genebank 中公布的大鼠HGF CDS 序列完全相符，最后亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1，酶切鑒定正確（圖1、2）。1：DNA 分子量

15、標(biāo)準(zhǔn)；2：pCMV-hHGF 的雙酶切（Xba 玉和BamH 玉）產(chǎn)物；3：pMD-hHGF 的雙酶切（Xba 玉和BamH 玉）產(chǎn)物；4：hHGF的PCR 產(chǎn)物（2187bp） 二、小鼠外周血hHGF 表達(dá)水平取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照實(shí)用肝臟病雜志圓園園9 年4 組動(dòng)物外周血后分離血清，經(jīng)ELISA 法檢測(cè)hHGF 含量， 結(jié)果顯示血清hHGF 水平逐步上升，并于首次水高壓注射后第12 天血清hHGF 達(dá)到最高水平（13.32 依1.08 ng/ ml）第15、18 和21 天血清hHGF 水平略有下降，但仍能維持在，較高水平，而對(duì)照組血清hHGF 水平基本為0 ng/ mg（圖3）。三、小鼠肝組織h

16、HGF 表達(dá)水平的變化實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組動(dòng)物肝組織勻漿，經(jīng)ELISA 法檢測(cè)hHGF 含量，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組肝組織hHGF 表達(dá)水平逐步上升，并于首次高壓注射后第21 天肝組織hHGF 達(dá)到最高水平（134依12.58 ng/mg），而對(duì)照組肝組織hHGF 水平基本為0 ng/ mg（圖4）。討論HGF 在1980 年代被發(fā)現(xiàn)，因它對(duì)肝細(xì)胞具有強(qiáng)的絲裂原作用而被命名為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子4。Stoker 等發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞分泌一種能促進(jìn)上皮細(xì)胞集落擴(kuò)散的細(xì)胞因子，稱(chēng)為離散因子5。通過(guò)對(duì)這兩種細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)和功能的研究，發(fā)現(xiàn)HGF 和SF 為同一物質(zhì)6。人的HGF 基因定位于第7 號(hào)染色體長(zhǎng)臂（7q2111）

17、，DNA 長(zhǎng)度約為70 kb，包含18 個(gè)外顯子和17 個(gè)內(nèi)含子。1989 年Nakamura 等4成功克隆了人的全長(zhǎng)HGFcDNA 。HGF 基因編碼含有728 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。成熟HGF 的相對(duì)分子量在非還原狀態(tài)下為90kD，由60kD 的琢鏈和30kD 的茁鏈經(jīng)二硫鍵連接而成的異二聚體，經(jīng)前體蛋白分解斷裂產(chǎn)生。HGF 具有潛在的肝臟營(yíng)養(yǎng)功能，如增加肝細(xì)胞再生和抑制肝細(xì)胞凋亡。此外，它對(duì)腎臟和肺同樣具有“營(yíng)養(yǎng)”功能。因此，HGF 作為一種抗凋亡和細(xì)胞保護(hù)的藥物可作用于各種組織，阻止多器官功能衰竭的發(fā)生，是目前重型肝炎臨床治療的常規(guī)藥物。然而矛盾的是重型肝炎/肝衰竭患者體內(nèi)雖然HGF 的水

18、平很高，但缺乏肝細(xì)胞再生的證據(jù)。鑒于重型肝炎患者肝臟炎癥水腫及纖維化明顯，肝竇及狄氏腔膠原化顯著，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞基底膜形成，肝竇及肝內(nèi)小血管阻塞。當(dāng)較大血管阻塞時(shí)，引起肝梗塞，肝血流量和血容量明顯減少，肝臟與血液的物質(zhì)交換將明顯障礙，血液中的藥物（特別是生物大分子藥物）難以作用于肝細(xì)胞。我們?cè)O(shè)想通過(guò)基因治療的手段將外源hHGF 基因?qū)牖颊吒渭?xì)胞，使得該基因在肝細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，從而自分泌hHGF 能與肝細(xì)胞表面受體c-met 結(jié)合，從而發(fā)揮最大的促肝細(xì)胞再生的作用。本研究從慢性乙型肝炎患者活檢的肝組織中提取總RNA，按照GenBank 中檢索出的hHGF 基因cDNA 序列， 進(jìn)行BLAST 同

19、源性檢索分析后，設(shè)計(jì)hHGF 編碼區(qū)全長(zhǎng)基因的上、下游引物，進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為2187bp 的TIMP-1 編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA。由于將PCR 產(chǎn)物直接酶切，與pcDNA3.0 表達(dá)載體相連的連接效率將很低下。因此，我們先將加“A”的PCR 產(chǎn)物與T 載體構(gòu)建中間重組體pMD-18 連接，以便最終將hHGF 正向克隆至pcDNA3.0 真核表達(dá)載體上。目前，應(yīng)用于基因治療的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)主要分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。其中，病毒載體系統(tǒng)在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中使用較多，但是其缺點(diǎn)在于具有自身免疫原性、毒性大、目的基因容量小、靶向特異性差以及潛在的致癌性等。故人們?cè)絹?lái)越重視非病毒載體的研

20、究。常用的非病毒載體包括裸質(zhì)粒DNA、脂質(zhì)體載體以及陽(yáng)離子多聚物載體等。但在使用非病毒載體進(jìn)行體內(nèi)基因治療時(shí)， 普遍存在轉(zhuǎn)染效率低的問(wèn)題7。本研究所使用的水高壓注射方法可以明顯提高非病毒載體的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率，使質(zhì)粒DNA 在肝臟獲得高效表達(dá)。水高壓注射，即將大體積的裸質(zhì)粒DNA 溶液經(jīng)小鼠或大鼠尾靜脈快速注入，大量的質(zhì)粒溶液導(dǎo)致循環(huán)血量的急劇增加，超過(guò)心臟負(fù)荷，血液積聚在肝血竇中不能回流，延長(zhǎng)了質(zhì)粒DNA在肝竇中的停留時(shí)間，從而被肝組織細(xì)胞攝取8耀10。我們前期研究表明，經(jīng)小鼠尾靜脈單次水高壓注射后，目的基因的表達(dá)局限于肝臟系統(tǒng)以?xún)?nèi)，且轉(zhuǎn)染效率高，72 小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)表達(dá)高峰，表達(dá)持續(xù)時(shí)間可維持一周

21、左右11。然而，關(guān)于該方法的詳細(xì)機(jī)理目前尚不清楚。本研究首次建立連續(xù)水高壓注射的方法，繼第一次水高壓注射100 mg 裸質(zhì)粒pCMV-hHGF 后，每3 天以同樣的方法重復(fù)注射一次，總共7 次，水高壓注射后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)明顯異常反應(yīng)。于首次水高壓注射后第0、3、6、9、12、15、18 和21 天分別檢測(cè)小鼠外周血和肝臟hHGF 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論外周血還是肝臟中hHGF 的表達(dá)始終能保持在一個(gè)較高的水平。理論上該方法可以無(wú)限制重復(fù)。因此可通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)保持目的基因在小鼠肝臟的長(zhǎng)時(shí)間高水平表達(dá)。重復(fù)水高壓注射法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，無(wú)明顯副作用，普遍適用于肝臟病基因治療的動(dòng)物研究。參考文獻(xiàn)1 KOE

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