迭香酸對D半乳糖致衰老小鼠抗氧化作用的研究

1、迭香酸對D半乳糖致衰老小鼠抗氧化作用的研究【摘要】目的 觀察迷迭香酸對D半乳糖誘導的衰老小鼠的抗氧化作用。方法 昆明小鼠連續(xù)6 w頸背部皮下注射D半乳糖1 mgg-1d-1復制亞急性衰老小鼠模型。造模的過程中，3個給藥組(低、中、高劑量) 分別以100、200和400 mgkg-1d-1的迷迭香酸分析純灌胃；同時設立3個含有等效劑量迷迭香酸的迷迭香提取物給藥組（1 000、2 000和4 000 mgkg-1d-1)對比灌胃。實驗6 w后處死動物,測定血清和腦中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)活性、甘油三酯（TG）水平；以及進行耐缺氧實驗。

2、結果 高劑量的迷迭香酸能明顯提高衰老小鼠血清和腦中的SOD活力(P0.01)、GSHPx活性(P0.05)，降低MDA含量(P0.05)和TG水平(P0.05)，且能明顯延長小鼠常壓耐缺氧時間(P0.05)。結論 迷迭香酸通過提高抗氧化酶活性，清除自由基，減少過氧化脂質生成而抗衰老。 【關鍵詞】 迷迭香酸；D半乳糖；衰老小鼠；抗氧化迷迭香酸具有多種生物活性，Chen等1報道具有較強的抗氧化活性,其作用強于咖啡酸,綠原酸,葉酸等。目前,對迷迭香酸的研究主要集中在抗炎2、抗病毒3、抑制腫瘤4以及在食品工業(yè)中的抗氧化活性等方面,而對其耐缺氧作用、抗衰老作用的研究卻相對較少。本實驗擬觀察對比迷迭香提取

3、物以及迷迭香酸對衰老小鼠血清和腦中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)活性、甘油三酯(TG)水平以及常壓耐缺氧時間的影響，對迷迭香酸的抗衰老作用及其機制進行初步探討。1 材料與方法1.1 動物 中澳合資米歇爾生物制品有限公司動物中心提供的健康昆明種小鼠，體重(202)g，雄性，生產(chǎn)許可證：SCXK（魯）20030011。在溫度為(222) 、濕度40%60%、12 光照交替的環(huán)境中飼養(yǎng)。自由進食標準飼料、攝水。小鼠適應性喂養(yǎng)1后隨機分為8組：空白對照組、衰老模型對照組、迷迭香酸低、中、高劑量）組和迷迭香提取物低、中、高劑量組。1.2 實驗藥品與試

4、劑 迷迭香酸南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司產(chǎn)品。迷迭香提取物粉劑，黃色粉末(迷迭香酸：10.6%)：上?？稻呕び邢薰旧a(chǎn)，批號：SP0607031。D半乳糖：上海試劑二廠產(chǎn)品，批號為F20050422。鹽酸普萘洛爾片：江蘇常州第四制藥廠生產(chǎn)，批號：050726。MDA、SOD、GSHPx檢測試劑盒、蛋白質定量試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。TG試劑盒為中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品。1.3 造模與給藥 參照文獻5方法制備亞急性衰老小鼠模型。除空白對照組外，其余各組小鼠每日頸背部皮下注射10%的D半乳糖生理鹽水溶液，注射容量為0.1 ml/10 g體重，1次/d，連續(xù)6 w?？瞻讓φ战M

5、頸背部皮下注射同等容量的生理鹽水。造模的同時，迷迭香酸低、中、高劑量組分別以每日100，200和400 mg/kg的迷迭香酸灌胃，迷迭香提取物低、中、高劑量組分別以每日1 000，2 000和4 000 mg/kg的迷迭香提取物灌胃，空白對照組與衰老模型對照組以同等容量蒸餾水灌胃。連續(xù)給藥42 d。每7 d稱體重1次，根據(jù)體重調整用藥量。1.4 常壓耐缺氧實驗 亞急性衰老小鼠模型造模成功后，分別從空白對照組，迷迭香酸以及迷迭香提取物各劑量組中隨機選取10只小鼠。從衰老模型對照組中隨機選取20只小鼠，其中10只設為鹽酸普萘洛爾陽性對照組。鹽酸普萘洛爾陽性對照組腹腔注射鹽酸普萘洛爾0.2 mg/1

6、0 g體重，給藥1次。給藥15 min后，將各組小鼠逐只放入裝有20 g鈉石灰的250 ml密閉的廣口瓶內，每瓶1只，加蓋以凡士林密封瓶口，觀察并記錄每只小鼠呼吸停止作為缺氧死亡時間。1.5 檢測指標 末次給藥后24 h，將小鼠摘除眼球取血，常規(guī)分離血清。將小鼠斷頸處死，于無菌條件下迅速取出腦組織，制備成10%的腦組織勻漿，離心后取上清液備用，采用考馬斯亮藍染色法定量腦勻漿蛋白。嚴格按照試劑盒方法測定血清和腦中的SOD、MDA、GSHPx、TG值。1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以xs表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和兩組間比較Dunnet t檢驗。2 結果2.1 體征狀況 與空白

7、對照組相比，衰老模型組小鼠皮下連續(xù)注射D半乳糖4 w后逐漸出現(xiàn)毛色暗淡，松散無光澤，形體瘦弱，行動緩慢，自發(fā)性活動減少，精神萎靡不振，反應不靈敏等衰老征象，且隨給藥時間延長，表現(xiàn)愈加明顯。迷迭香酸各劑量組小鼠體征狀況介于模型組和空白對照組之間，但隨著劑量增高，小鼠毛色、光澤、反應靈敏度等情況逐漸得以改善。與迷迭香酸各劑量組相比，含有等效劑量迷迭香酸的迷迭香提取物各組小鼠的體征狀況較好。2.2 體重變化 體重的改變是研究衰老變化的重要生理指標之一，過早的出現(xiàn)變化可說明衰老的程度。從圖可以看出，給藥2 w后，小鼠體重增加量普遍下降。原因可能在于：灌胃操作對食道黏膜有一定刺激，影響動物食欲，引起體重

8、下降。但經(jīng)過一定的適應期，小鼠體重又有所回升。衰老模型對照組的體重增加量顯著小于空白對照組(P0.01)；迷迭香酸、迷迭香提取物各劑量組對衰老小鼠的體重均無影響(P0.05)。2.3 迷迭香酸對衰老小鼠血清和腦SOD、MDA、GSHPx的影響 由表1可見，衰老模型組與空白對照組相比，其血清和腦SOD活性、GSHPx活性顯著降低(均P0.01)，而MDA含量顯著升高(均P0.01)，顯示出機體抗氧化能力下降，而脂質過氧化產(chǎn)物增多。與衰老模型組相比，迷迭香酸組都能不同程度地提高衰老小鼠血清和腦SOD活性、GSHPx活性，同時降低MDA含量 (P0.05，P0.01)，尤以中、高劑量效果最為明顯，呈

9、現(xiàn)量效關系。與迷迭香酸各劑量組相比，含有等效劑量迷迭香酸的迷迭香提取物各組對于小鼠血清和腦SOD、GSHPx的升高以及MDA的降低程度都大于相應的迷迭香酸組。表1 迷迭香酸對衰老小鼠血清和腦SOD、MDA、GSHPx的影響（略）與空白對照組比較：1)P0.01；與衰老模型組比較：2)P0.05，3)P0.01圖1 迷迭香酸對衰老小鼠體重的影響（略）2.4 迷迭香酸對衰老小鼠血清TG的影響 衰老模型組血清TG（1.181.04）mmol/L較空白對照組（0.490.12）mmol/L顯著升高(P0.01)；與衰老模型組相比，迷迭香酸低劑量組（1.050.78）mmol/L無顯著差異(P0.05)

10、，而中（0.890.22）mmol/L、高劑量組（0.800.34）mmol/L都能明顯降低衰老小鼠血清中的TG(均P0.05 )；迷迭香提取物各劑量組也能降低小鼠血清中的TG，但低劑量組（0.920.43）mmol/L無顯著差異(P0.05)，中（0.770.24）mmol/L、高劑量組（0.680.17）mmol/L效果最為明顯(P0.05，P0.01)。2.5 迷迭香酸對衰老小鼠常壓耐缺氧時間的影響 與空白對照組(20.252.45)min相比：衰老模型組耐缺氧時間(16.422.16)min顯著下降(P0.01)；鹽酸普萘洛爾陽性對照組小鼠耐缺氧時間(23.363.77)min顯著延長

11、(P0.01)，因為鹽酸普萘洛爾能阻斷心肌的受體，產(chǎn)生負性肌力作用，使物質代謝減慢，降低心肌耗氧量，提高心肌耐缺氧能力。與衰老模型組相比，迷迭香酸中(17.343.04)min、高劑量(18.462.53)min能明顯提高衰老小鼠耐缺氧時間(P0.05)，低劑量(16.552.31)min雖能提高小鼠耐缺氧時間，但無顯著差異(P0.05)。迷迭香提取物中(19.232.79)min、高劑量(20.112.37)min也能明顯提高小鼠耐缺氧時間(P0.05，P0.01)，低劑量組(17.873.08)min則與衰老模型組無顯著差異(P0.05)。3 討論 本實驗中衰老模型組在連續(xù)注射D半乳糖6

12、w后，小鼠血清和腦SOD活性、GSHPx活性顯著下降，MDA含量、TG水平顯著升高，耐缺氧時間和體重明顯下降，同時還出現(xiàn)了一系列的衰老體征，說明本實驗中衰老模型的建立是成功的。 根據(jù)自由基學說理論，機體衰老時,抗氧化系統(tǒng)抗氧化能力下降,自由基代謝產(chǎn)物增加,進而加速機體衰老。因而提高抗氧化酶的活性,降低自由基代謝產(chǎn)物的生成，是延緩衰老的重要途徑6。本實驗結果顯示：給予中、高劑量的迷迭香酸可顯著提高機體抗氧化酶活性，降低MDA含量和血清TG水平，且隨著迷迭香酸劑量的升高呈現(xiàn)量效關系。提示迷迭香酸可顯著降低機體的氧化負荷，抑制脂質過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，減輕由于脂質過氧化反應而導致脂肪蓄積引起的TG

13、升高。缺氧是臨床上常見的病理過程，機體對缺氧的耐受性取決于機體的代謝耗氧率和代償能力。在低氧環(huán)境下,機體內發(fā)生一系列氧自由基代謝改變,表現(xiàn)為抗氧化能力下降和脂質過氧化反應增強。本實驗結果顯示：中、高劑量的迷迭香酸能提高衰老小鼠的常壓耐缺氧時間。其作用機制可能是迷迭香酸能使機體耗氧量減少，氧自由基的生成隨之減少。而氧自由基的生成量越少，機體的抗氧化能力就越強，壽命就越長7。 鼠尾草酸、迷迭香酸和迷迭香酚是迷迭香提取物中的三種最有效的抗氧化組分，它們的抗氧化活性依次遞減8。本試驗結果顯示：含有等效劑量迷迭香酸的迷迭香提取物對衰老小鼠機體氧化抗氧化系統(tǒng)及耐缺氧能力的作用比單純使用迷迭香酸的作用效果好

14、，由此推測：迷迭香提取物對D半乳糖誘導的衰老小鼠抗衰老的作用正是迷迭香酸和其他有效成分協(xié)同作用的結果。迷迭香酸作為迷迭香提取物抗衰老的主要有效成分之一，其機制可能是由于迷迭香酸能夠作為斷鏈型自由基終止劑9，捕獲過氧自由基，抑制過氧化氫以及脂質過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，由于生成的酚氧自由基相對穩(wěn)定，從而阻斷了自由基鏈的傳遞和增長,進而抑制了氧化反應。由此可見，迷迭香酸可以有效減少機體內的氧化性損傷，改善機體的抗氧化能力，其抗衰老作用是多方面的，可以將其作為一種抗衰老藥物加以開發(fā)和應用?！緟⒖嘉墨I】 1 Chen JH，Ho CT.Antioxidant activities of caffeic aci

15、d and its related hydroxycinnamic acid compoundsJ.J Agric Food Chem,1997；45(7):23748.2 Takano H，Osakabe N，Sanbongi C,et al.Extract of Perilla frutescens enriched for rosmarinic acid，a polyphenolic phytochemical，inhibits seasonal allergic rhino conjunctivities in humansJ.Exp Biol Med，2004；229（3）:2475

16、4.3 Kim HK，Lee HK，Shin CG,et al.HIV integrase inhibitory activity of agastache rugosaJ.Arch Pharm Res，1999；22(5):5203.4 Hooker CW，Lott WB,Harrich D.Inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase target distinct phases of early reverse transcriptionJ.J Virology，2001；75（7）:3095104.5 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學M.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：14657.6 牛嗣云，龐曉靜,陳 龍，等.松花粉對亞急性衰老模型大鼠抗衰老作