載脂蛋白(a)五核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列基因型的檢測

1、載脂蛋白(a)五核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列基因型的檢測    載脂蛋白(a)Apo(a)是僅存在于脂蛋白(a)Lp(a)的一種高分子量的糖蛋白，由肝臟合成，其氨基酸組成及基因結(jié)構(gòu)與血纖溶酶原十分相似。它不僅促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，還能抑制血纖維蛋白溶解，導(dǎo)致血栓形成。人Apo(a)結(jié)構(gòu)基因定位于第六號染色體長臂     作者：胡波周新邵華 單位：胡波（430071 武漢，湖北醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系）；周新（430071 武漢，湖北醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系）；邵華（430071 武漢，湖北醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)

2、院醫(yī)學(xué)檢驗系） 關(guān)鍵詞： 載脂蛋白(a)；串聯(lián)重復(fù)序列；聚合酶鏈反應(yīng)；基因型 【摘要】目的建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確、實用的人載脂蛋白(a)五核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列(pentanucleotide repeats, PNR)基因型的檢測方法。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)特異性擴增Apo(a)5端調(diào)控區(qū)PNR，擴增產(chǎn)物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合硝酸銀染色，觀察Apo(a)PNR的多態(tài)性。結(jié)果應(yīng)用該法檢測了153例健康人Apo(a)5端調(diào)控區(qū)PNR基因型，共檢出7種等位基因和11種基因型，等位基因和基因型均以(TTTTA)n串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)表示。等位基因頻率分別為4(0.007)，5(0.0

3、26)，7(0.006)，8(0.74)，9(0.213)，10(0.007)，11(0.003)?；蛐皖l率分別為4/8(0.007)，4/9(0.007)，5/8(0.039)，5/9(0.013)，7/8(0.013)，8/8(0.557)，8/9(0.294)，8/10(0.007)，8/11(0.007)，9/9(0.052)，9/10(0.007)。結(jié)論該方法簡便、快速、重復(fù)性好，適于一般實驗室開展及大規(guī)模人群調(diào)查。    A pentanucleotide repeat sequence genotype of apolipoprotein

4、 (a) HU Bo, ZHOU Xin, SHAO Hua. Department of Medical Laboratory Science, Second College of Clinical Medicine, Hubei Medical University, Wuhan 430071, China 【Abstract】ObjectiveTo establish a simple, rapid, accurate method for detecting the pentanucleotide repeats (PNR) genotype of human apolipoprote

5、in (a) Apo(a).MethodThe PNR in the 5 control region of the Apo(a) was amplified by using polymerase chain reation (PCR). The PCR products were subjected to electropherosis on 6% denature polyacrylamide gels. The gels were stained with AgNO3 and genotypes of the PNR were distinguished.ResultsUsing th

6、is method, we detected the PNR genotypes in the 5 control region of the Apo(a) gene in 153 health individuals. We detected 11 different genotypes and 7 different alleles containing 4, 5, 7, 8, 9, 10 or 11 PNR with PCR product lengths ranging from 76 to 111 bp. Allele frequence distributions were 4 (

7、0.007), 5(0.026), 7(0.006), 8(0.74), 9(0.21), 10(0.007) and 11(0.003). Distributions of prevalence genotype frequencies were 4/8(0.007), 4/9(0.007), 5/8(0.039), 5/9(0.013), 7/8(0.013), 8/8(0.557), 8/9(0.294), 8/10(0.007), 8/11(0.007), 9/9(0.052), and 9/10(0.007) respectively.ConclusionThis method is

8、 considered to be a simple and rapid technique for obtaining accurate result. It is suitable for routine laboratories and large-scale population studies. 【Key words】Apolipoprotein(a);Pentanucleotide repeats;Polymerase chain reaction;Genotype 載脂蛋白(a)Apo(a)是僅存在于脂蛋白(a)Lp(a)的一種高分子量的糖蛋白，由肝臟合成，其氨基酸組成及基因結(jié)構(gòu)

9、與血纖溶酶原十分相似。它不僅促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，還能抑制血纖維蛋白溶解，導(dǎo)致血栓形成。人Apo(a)結(jié)構(gòu)基因定位于第六號染色體長臂，在其5端側(cè)翼1.5 kb內(nèi)存在一個五核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列(PNR)顯示多態(tài)性即(TTTTA)n串聯(lián)重復(fù)，并與不同的啟動子活性有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Lp(a)水平升高是動脈粥樣硬化、動脈重新狹窄和卒中的一種主要危險因子，而Apo(a)(TTTTA)n的串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)與血漿Lp(a)濃度間顯著負(fù)相關(guān)，并可獨立解釋個體間Lp(a)水平變異的10%14%1，這些領(lǐng)域的研究已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。作者采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色

10、技術(shù)，建立一種快速、準(zhǔn)確測定Apo(a)PNR (TTTTA)n基因型的方法，并調(diào)查了我國人群中Apo(a)基因型與等位基因頻率的分布。 材料與方法 一、材料 1.試劑來源：dNTPs(Sangon公司)、Taq DNA聚合酶、DNA片段長度標(biāo)志物(Pbr322 DNA/Hae markers和Pbr322 DNA/Msp markers)，均為華美生物公司產(chǎn)品；pGEM-T Vector Systeml (Promega公司)，其余試劑為分析純。 2.引物：引物參照Malgaretti等2設(shè)計，由加拿大Sangon公司合成。序列為P1：5-GAATTCATT-TGCGGAAAGATTG-3；

11、P2：5-CTTCAACCGGGGTGA-GAGTCTC-3。特異性擴增Apo(a)5端調(diào)控區(qū)信號密碼子上游1 373 bp處的(TTTTA)n五核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列，產(chǎn)物片段范圍為76111 bp。 二、研究對象 湖北地區(qū)無血緣關(guān)系漢族健康人153名，為本院門診健康體檢者，排除心腦血管疾病及肝、腎、內(nèi)分泌等影響脂質(zhì)代謝的疾病。血清總膽固醇(TC)為(4.20±0.68) mmol/L，甘油三酯(TG)為(1.00±0.38) mmol/L。 男性86名，女性67名，年齡3479歲。取空腹12 h靜脈血，EDTA-K2抗凝。 三、試驗方法 1.模板DNA提?。旱饣c法，參照L

12、oparev等3法加以改良，取EDTA抗凝血100 l，加無菌雙蒸水100 l，混勻，加入6 molL-1 NaI 200 l，反復(fù)混勻20 s，再加入400 l氯仿/異丙醇(24/1)，振蕩20 s，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加0.6倍體積異丙醇，室溫靜置15 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 ml 70%乙醇，然后12 000 r/min離心10 min，棄上清，室溫干燥后溶于30 l TE溶液(pH8.0)，置-20儲存。 2.PCR擴增：反應(yīng)體系為50 l。其中含10×擴增緩沖液、dNTPs各100 mol/L；引物P

13、1、P2各1 mol/L；模板DNA 200 ng。置熱循環(huán)儀(PE2400型，Perkin-Elmer公司)中94預(yù)變性1.5 min后，再加入Taq DNA聚合酶1.5 U。然后按下列程序循環(huán)35次，即94變性40 s，59退火30 s，72延伸40 s，最后于72再延伸5 min。取產(chǎn)物10 l，經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶(EB)染色，紫外燈下觀察擴增是否成功。 3.擴增產(chǎn)物的檢測：T=6%，C=5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(含尿素)。取1.5 l PCR產(chǎn)物、2 l載樣緩沖液、2.5 l Tris-EDTA液混合，點樣于相應(yīng)的上樣孔。在電泳儀(Sequi-GenR GT，BIO-R

14、AD公司)上進行電泳。用銀染法染色，即先將凝膠在10%乙醇中浸泡10 min后，用1%硝酸處理3 min，蒸餾水沖洗，浸入0.18%硝酸銀中1 h，再用蒸餾水沖洗，最后用3%碳酸鈉(含0.019%甲醛)顯影至各帶清晰可見后，用10%醋酸停顯并照相記錄。 4.DNA序列測定及標(biāo)準(zhǔn)物構(gòu)建：挑選Apo(a)(TTTTA)串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)分別為5和9的等位基因用pGEM-T載體克隆，然后采用本實驗室的ABI310 PRISMTM全自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測序。Apo(a) DNA片段分子量的確認(rèn)以此為內(nèi)對照，結(jié)合Pbr322/Hae和Pbr322 DNA/Msp DNA片段標(biāo)記，用

15、回歸法計算出DNA片段大小。對所有待測標(biāo)本進行分型，按串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)命名等位基因。 四、統(tǒng)計學(xué)處理 使用SAS軟件包，基因頻率采用基因計數(shù)法計算。研究對象與Hardy-weinberg平衡符合程度用2檢驗?；蛐突虻任换蝾l率比較采用2檢驗。 結(jié)果 1.Apo(a)PNR(TTTTA)n的等位基因和基因型頻率的確認(rèn)：測定153份樣品，檢出7種等位基因，片斷長度為76111 bp。根據(jù)(TTTTA)n串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)分別命名為：4，5，7，8，9，10，11。同時檢出11種不同基因型，分別命名為：4/8，4/9，5/8，5/9，7/8，8/8，8/9，8/10，8/11，9/9，9/10。

16、 2.Apo(a) PNR (TTTTA)n等位基因和基因型頻率分布：153名健康漢族人中Apo(a) PNR (TTTTA)n等位基因及基因型頻率分布分別見表1、2。男、女組間差異均無顯著意義(P0.05)。經(jīng)2檢驗，此組人群Apo(a) PNR (TTTTA)n的基因型分布符合Hardy-weinberg平衡，實際檢出基因型頻數(shù)與預(yù)期基因型頻數(shù)基本一致。 表1湖北漢族人Apo(a)PNR(TTTTA)n等位基因頻率分布    等位基因 擴增片段(bp) 等位基因頻率    男(86名) 女(67名) 

17、   4    76 0.012 -    5 81 0.012 0.045    6 86 - -    7 91 0.012 -    8 96 0.738 0.738    9 101 0.208 0.217    10 106 0.012 -   &#

18、160;11 111 0.006 -    表2湖北漢族人Apo(a)PNR(TTTTA)n基因型頻率分布    基因型 擴增片斷    (bp) 基因型頻率    男(86名) 女(67名)    4/8    76/96    0.012    -  &#

19、160; 4/9 76/101 0.012    -    5/8 81/96 0.012    0.075    5/9 81/101 0.012 0.015    7/8 91/96 0.023    -    8/8 96/96 0.593 0.522    8/

20、9 96/101 0.244 0.358    8/10 96/106 0.012    -    8/11 96/111 0.012    -    9/9 101/101 0.070 0.030    9/10 101/106 0.012    - 3.作者檢測結(jié)果與國外學(xué)者檢測的其他人種Apo(a) PNR (T

21、TTTA)n等位基因頻率分布進行比較：表3表明，串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)為4、5的等位基因只出現(xiàn)在中國湖北漢族人中，而串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)為6的等位基因多出現(xiàn)在黑人中，中國湖北漢族人Apo(a) PNR (TTTTA)n等位基因頻率分布與提洛爾人、丹麥高加索人、南非黑人比較，差異均有顯著意義(均為P0.01)，表明(TTTTA)n等位基因頻率分布具有種族差異性。 表3不同人種Apo(a)PNR(TTTTA)n等位基因 頻率分布比較    等位    基因 擴增    片斷 (bp)

22、等位基因頻率    提洛爾    人1 (130名) 丹麥高加    索人1 (154名) 南非黑    人1 (112名) 中國人    (本文) (153名)    4    76 - - - 0.007    5 81 - - - 0.026  

23、0; 6 86 - - 0.018 -    7 91 0.004 0.003 0.085 0.006    8 96 0.661 0.666 0.734 0.740    9 101 0.185 0.146 0.085 0.213    10 106 0.127 0.182 0.040 0.007    11 111 0.023 0.003 0.036 0.003 4.pGEM-Apo

24、(a)PNR測序結(jié)果顯示：挑選Apo(a) PNR (TTTTA)n串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)分別為5和9的等位基因進行測序，與國外所測定的高加索人的等位基因比較，發(fā)現(xiàn)除核心序列(TTTTA)的串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同外，其他堿基序列完全一樣。 討論 Apo(a)5端調(diào)控區(qū)存在(TTTTA)n的基因多態(tài)性，它可能與人類基因組中其他串聯(lián)重復(fù)序列一樣，是由于DNA復(fù)制過程中堿基重復(fù)或突變產(chǎn)生4。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國外陸續(xù)報道了一些Apo(a)5端調(diào)控區(qū)(TTTTA)n等位基因的檢測方法：PCR結(jié)合ASO探針雜交，PCR結(jié)合非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳并用溴化乙啶(EB)染色等，這些方法或有放射性污染，或費時費

25、力，結(jié)果不穩(wěn)定，不利于在普通實驗室開展。作者采用PCR特異性擴增Apo(a)5端調(diào)控區(qū)(TTTTA)n等位基因序列，擴增產(chǎn)物用變性聚丙烯酰胺凝膠高壓電泳結(jié)合硝酸銀染色，不僅提高了分辨率，靈敏度，也縮短了操作時間。由于在聚丙烯酰胺中加入了甲酰胺和尿素，還減少了異源雙鏈的形成，所得結(jié)果容易保存。檢測了153名中國湖北健康漢族人，檢出7種等位基因，11種基因型，與國外學(xué)者所報道的高加索人、黑人比較，發(fā)現(xiàn)這個位點的等位基因頻率在不同的人種中有顯著的差異。在中國湖北漢族人和黑人中，低頻率串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)的等位基因比較常見，串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)為6的等位基因多見于黑人中，而串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)為4和5的等位

26、基因僅見于中國湖北漢族人中。串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)為5和9的等位基因DNA測序結(jié)果與國外報道的高加索人Apo(a) PNR (TTTTA)n的DNA序列完全一致，證明本法所鑒定的基因型完全準(zhǔn)確可靠，同時以此為內(nèi)對照，參照PBR322/Hae和PBR322/Msp DNA片段標(biāo)記，對其他待測標(biāo)本進行分型命名。Amermiya等5對日本人群的調(diào)查研究中，也發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)為5的等位基因，且基因頻率分布與中國湖北漢族人相近，這可能是因為他們所在地域相近又屬于同一人種的原因造成。高加索人串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)為10的等位基因頻率(0.182)明顯高于中國湖北漢族人(0.007)和黑人(0.04)，而又

27、未見n為4、5、6低串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)等位基因的檢出。有些學(xué)者認(rèn)為6(TTTTA)n等位基因頻率的這種分布的不同很可能是由于人種的遺傳漂變(genetic drift)、突變和遷移引起，與中國漢族人和黑人比，高加索人更為古老有關(guān)。 采用PCR擴增結(jié)合變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色，檢測Apo(a)5端調(diào)控區(qū)(TTTTA)n的基因型，該方法簡便快速，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，適合于普通實驗室開展，并可用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查以及對動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)病機制和遺傳因素的深入研究。 基金項目：湖北省科委重點課題資助項目(96192002) 參考文獻 1Marion T, Silvano K, Arno L, et al. A pentanucleotide repeat polymorphism in the 5 control reagion of the Apolipoprotein (a) gene is associated with lipoprotein (a) plasma concentrations in Caucasians. J Clin Invest, 1995,96