等位基因特異性-PCR聯(lián)合限制性內(nèi)切酶消化法檢測JAK2V617F突變講解

1、等位基因特異性-PCR聯(lián)合限制性內(nèi)切酶消化法檢測JAK2V6仃F突變08-12-07 09:18:00 編輯：studa20匡I習(xí)作者：申徐良 陳方平 魏 武 張梅香 史文芝秦小琪徐洪亮【摘要】目的：建立敏感特異的JAK2V617F點(diǎn)突變的臨床檢測方法。方法：基因組DNA從 HEL細(xì)胞或正常志愿者外周血中提取。采用等位基因特異性 -PCR(Allele specific-PCR ，AS-PCR和限制性內(nèi)切酶消化的方法檢測基因組中 JAK2V617F突變。結(jié)果：本 AS-PCF法可對JAK2基因擴(kuò)增出364 bp的內(nèi)參照條 帶，當(dāng)存在JAK2V617F突變時，又可以擴(kuò)增出203 bp的突變條帶。

2、只有野生型 內(nèi)參照條帶364 bp可被BsaXI消化切害嘰結(jié)論：AS- PCF法和限制性內(nèi)切酶法 是檢測JAK2V617F突變的敏感特異的檢測方法，可以成功應(yīng)用于臨床檢測?！娟P(guān)鍵詞】等位基因特異性-PCR JAK2V617F突變；限制性內(nèi)切酶BsaXIAbstractObjective:To establish a sen sitive and specifictest for JAK2V617F poi nt mutati on. Methods: Geno mic DNA was isolated from HEL cells or Peripheral-blood cells from

3、no rmal volun teer. Allele-specific polymerase cha in reacti ons (AS-PCR) and restrictio n en zyme digesti on were performed to detect the mutatio n in geno mic DNA.Results:A control ban d(364 bp) can be obta in ed by AS-PCR,a nd a muted ban d(203 bp) can be obta in ed only whe n JAK2V617F was prese

4、 nted. Only wildtype con trol ban d(364 bp) can be digested by restriction enzyme BsaXI .Conclusion:AS -PCR and restriction enzymedigestio n were sen sitive and specific tests for JAK2V617F point mutati on, and can be successfully used for cli ni cal test.Key wordsAllele specific-PCR;JAK2V617F mutat

5、io n;Restrictio nen zyme BsaXIJAK2 基因?qū)?JAKs(Janus kinases/Just another kinases )家族成員，是胞漿非受體性酪氨酸激酶，在多種造血生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān) 鍵作用1。2005年，Baxter 2和Kralovucs 3先后發(fā)現(xiàn)大部分骨 髓增殖性疾病患者攜帶有一個獲得性的JAK2基因突變-JAK2V617F,該基因突變位于JAK2基因第1 849位，原來的鳥嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取代，導(dǎo) 致原位于617位的纈氨酸錯義編碼為苯丙氨酸(G -T, JAK2V617F)。該突變的 陽性率在PV中高達(dá)65%- 97%

6、ET為23%- 57呀口 IMF為35%-57% 在AML/CML中有少量表達(dá)26。JAK2V617F基因突變的發(fā)現(xiàn)是近年來骨髓增 殖性疾病發(fā)病機(jī)制的突破性進(jìn)展，因此有學(xué)者將其稱為骨髓增殖性疾病的“JAK2時代”。JAK2V617F勺發(fā)現(xiàn)對于臨床上骨髓增殖性疾病的診斷和鑒別診 斷有非常重要的意義。為此，我們在臨床上建立了兩種敏感特異的 JAK2V671F 點(diǎn)突變的檢測方法等位基因特異性 PCRt(Allele specific-PCR , AS- PCR和限制性內(nèi)切酶消化法。這兩種方法的應(yīng)用，有利于提高骨髓增殖性疾病 的臨床診斷水平。1 材料與方法1.1 細(xì)胞培養(yǎng)HEL細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海

7、科學(xué)研究院，培養(yǎng)于含10%臺牛血清(Hyclone)、100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素的 RPMI1640(Gibco)培養(yǎng)基 中，置于37 C、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 3 d換液一次。待細(xì)胞 生長至80%匚合時以1 ：3的比例傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用作實(shí)驗(yàn)。1.2 基因組DNA制備HEL細(xì)胞基因組和正常人血液基因組 DNA用血液基因組提取試劑盒(上 海生物工程公司產(chǎn)品)提取。1.3 AS-PCR及產(chǎn)物分析PCR引物合成工作由北京奧科生物公司完成。各引物序列如下：公用反 向引物(R1)5 ' -CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTC

8、野生型正向引物 (F1)5 ' -ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAA64 bp)、突變特異性正向 弓 I物(F2) 5 ' -AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT03 bp )。PCR反應(yīng)體 系為50卩L,每管中加入80 ng DNA模板，公用反向引物(10卩M)1卩L，突變特異性正向引物(10卩M) 1卩L或野生型正向引物(10卩M) 1卩L，10X PCF緩沖液 5 卩 L，25 mM MgCI23 卩 L， 10 mM dNTPs 1 卩 L，5 U/ 卩 L 的 Taq 聚合酶1卩L,最后用去離子水補(bǔ)足50卩L。置于MJ

9、Research PTC-100基因 擴(kuò)增儀中按以下程序擴(kuò)增：先94 C變性11 min,然后進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，包括變 性 40 s (94 C)、退火 1 min (54 C)、和延伸 1 min (72 C),擴(kuò)增 35 循環(huán)，最后72 C延伸10 min。 AS-PCR物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳 鑒定，應(yīng)用AlphaEaseFC凝膠成像處理系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。1.4.JAK2V617 F的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定BsaXI限制性內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品。酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物20 卩L，NEB Buffer 4 4 卩L，BsaXI 1卩L (2U)，去離子水15卩L,總體積 40卩L

10、，37 C溫育4 h。酶切完畢后于2%瓊脂糖凝膠中電泳觀察結(jié)果。2 結(jié)果HEL細(xì)胞株是人紅白血病細(xì)胞株，有學(xué)者6證實(shí)HEL細(xì)胞為 JAK2V617F基因突變的純合子。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們以HEL細(xì)胞作為一個已知的含有JAK2V617F突變的的陽性標(biāo)本，用于建立 JAK2V617F突變的檢測方 法。AS-PCF過程中野生型正向弓I物(F1)5 ' -ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAG AAAG3'和公用反向引物(R1)5 ' -CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTW 位于基因組上該突變位點(diǎn)的上游和下游，擴(kuò)增產(chǎn)物為 364 bp ，該擴(kuò)增作為 AS- PCR的陽性對照，用于檢驗(yàn)基因組 DNA提取的質(zhì)量和PCR體系的正確性。無論 基因組中是否存在JAK2V617F突變，只要提取的基因組 DNA完整，PCR體系正 確，這兩條引物都可以擴(kuò)增出364 bp的產(chǎn)物。突變特異性正向引物(F2) 5 '- agcatttggttttaaattatggagtatat針對突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的突變弓I物，該弓I 物3'端包含2個錯配的核苷酸。當(dāng)基因組中存在 JAK2V617F突變時，該引物 與公用反向引物(R1)可以擴(kuò)增出203 bp