細(xì)胞免疫組化（精編版）

1、WORD格式細(xì)胞免疫組化細(xì)胞爬片的免疫組化1. 細(xì)胞爬片， 5 天后進(jìn)行免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色定。2. PBS 清洗標(biāo)本3 次各 1min 。3. 冰丙酮固定15min( 或 4%多聚甲醛固定30min) 。4. 空氣干燥 5min。5. PBS清洗標(biāo)本 3 次各 2min 。6. 0.5%TritonX-100(DPBS配) 孵育1 次 20min。7. PBS清洗標(biāo)本 3 次各 2min 。8.3%H2O2（試劑 A）孵育 15min 。9. DPBS清洗標(biāo)本 3 次各 2min。10. 封閉血清孵育（試劑B） 20min 。11. 一抗孵育（滴度1： 200，濕盒） 4過(guò)夜或 37 60m

2、in 。陰性對(duì)照最好用一抗來(lái)源血清，否則用PBS液12.PBS 清洗標(biāo)本3 次各 5min 。13 . 二抗工作液孵育（濕盒試劑C） 37 30min。14 .PBS 清洗標(biāo)本3 次各 5min 。15. 試劑D（濕盒）3730min 。16、PBS清洗標(biāo)本3 次各5min。17、DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）約310min。專業(yè)資料整理18、蒸餾水洗2 次 1min。19、蘇木素復(fù)染0.51min 。20、自來(lái)水洗返藍(lán)。21. 梯度酒精脫水75， 85， 95， 100%各 3min 。22. 二甲苯透明2 次 3min 。23、中性樹(shù)膠封片。注意事項(xiàng)：1、良好的細(xì)胞爬片是進(jìn)行免疫組織細(xì)

3、胞的基礎(chǔ)，要獲得良好細(xì)胞爬片須注意以下：a 對(duì)于粘附分子較少的細(xì)胞爬片時(shí)間要達(dá)5 天以上這樣細(xì)胞爬片才較牢固沖洗時(shí)不易脫片；b 接種的細(xì)胞密度適中以2*104/ml為宜，若密度太高5 天后細(xì)胞連接成片沖洗時(shí)易脫片；2、冰丙酮固定后玻片可密閉保存于4C 冰箱，冰丙酮固定時(shí)會(huì)使細(xì)胞收縮，可用80%冰丙酮或 2%多聚甲醛固定。3、沖洗時(shí)只須輕輕振蕩培養(yǎng)皿，（不可用吸管太用力吹，易脫片）4、加一抗、二抗后沖洗時(shí)第一次須將玻片傾斜5、TritonX-100表面活性劑，脫去細(xì)胞膜中最主要的成分脂質(zhì)，對(duì)于抗原表達(dá)在胞漿或胞核者方使用，對(duì)于抗原表達(dá)在 胞漿者時(shí)間要控制好，使其破壞細(xì)胞膜而核膜破壞較少。細(xì)胞爬片

4、固定后在孔板里做免疫組化還是粘到載玻片上再做？1. 如果不看熒光，兩種都可以，感覺(jué)粘好了再做要快一些， 但是做的時(shí)候要防止脫落。如果看熒光，就不能用中性樹(shù)膠粘，直接在24 孔，或 6 孔板里做才可以。中性樹(shù)膠要折光，散射的光干擾，沒(méi)辦法看細(xì)胞本身的熒光。2. 孔板里做免疫組化較方便，細(xì)胞比蓋玻片易貼壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。細(xì)胞爬片固定后粘到載玻片上不太可能，只有開(kāi)始就讓細(xì)胞貼在玻片上爬片。3. 我沒(méi)有在多孔板里做過(guò)，其實(shí)把細(xì)胞爬在蓋玻片上也不是很麻煩，偶這樣做很少掉片。先將消化好的細(xì)胞懸液滴幾滴在蓋玻片上，由于液體的表面張力，細(xì)胞懸液一般不會(huì)流淌到蓋玻片外面，等細(xì)胞大概

5、貼壁后，不同細(xì)胞貼壁時(shí)間稍有不同，大概6、7 個(gè)小時(shí)，差不多貼壁再加生長(zhǎng)液，開(kāi)始滴的細(xì)胞的數(shù)量你要摸索一下， 到固定時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)到80左右比較合適。偶是在蓋玻片上做的，首先細(xì)胞要爬的勻一些，象dongwp戰(zhàn)友的就很好。然后傾去生長(zhǎng)液沖洗、固定之后，用小鑷子或手指把玻片從六孔板拿出來(lái)。擦干蓋玻片的背面，在玻片WORD格式背面四周涂一點(diǎn)凡士林，粘貼于載玻片上，這一點(diǎn)很重要，在以后的操作里會(huì)省去蓋玻片經(jīng)常脫落麻煩。細(xì)胞爬片的保存和抗原修復(fù)問(wèn)題總結(jié)1.體濃度細(xì)胞爬片可以用, 請(qǐng)告知 . 多謝 !含疊氮鈉PBS液保存. 但不知道具0.04-0.08%。但是我建議對(duì)于細(xì)胞爬片，還是盡量快的進(jìn)行處理，以防不必

6、要的問(wèn)題!2. louischenwrote:但我的細(xì)胞爬片經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛固定，PBS沖洗后直接就放在了-20度，還能用于免疫組化嗎?!丟失3. mRNA原位雜交經(jīng)4%多聚甲醛固定 , 固定液需加DEPC水。其它建議用甲醇固定。-20 度保存4. 如果是 4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存兩周沒(méi)問(wèn)題。時(shí)間再長(zhǎng)就沒(méi)試過(guò)了。5. 丙酮中固定5-10 分鐘，然后風(fēng)干，放置4 度保存過(guò)WORD格式夜應(yīng)該是沒(méi)有問(wèn)題。不要固定過(guò)夜，蛋白質(zhì)固定過(guò)度，會(huì)影響抗原的暴露，影響免疫組化結(jié)果。如果是胞漿或胞核抗原出現(xiàn)假陰性結(jié)果，可考慮應(yīng)用0.5%的 triton-100孵育 30 分鐘，滲透

7、細(xì)胞膜。如果玻片沒(méi)有經(jīng)過(guò)特殊處理，不要用其他抗原修復(fù)的方法，會(huì)造成掉片，我曾有過(guò)這方面的體會(huì)6. 丙酮固定后， PBS洗滌 3 次，即可保存至4 度冰箱備用。7. (1) 細(xì)胞爬片先用TBS洗 3 次，每次 5 分鐘(2)4% 多聚甲醛固定，室溫，20 分鐘(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脫水，通風(fēng)櫥內(nèi)干燥，-80度保存。 2 周沒(méi)有問(wèn)題的，我保存過(guò)2 個(gè)月都有信號(hào)，不過(guò)還是保存時(shí)間短一點(diǎn)的好8. 我的心肌細(xì)胞爬片用不同濃度的乙醇依次脫水后, 就放在室溫中 , 因?yàn)槭且碾婄R,但是學(xué)校電鏡壞了, 呵呵, 所以放了一個(gè)月后去拍, 還是很好9. 細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮

8、等固定，用PBS沖洗后，晾干，放在-20 度保存一個(gè)月沒(méi)有問(wèn)題的。10. 細(xì)胞爬片，有機(jī)溶劑如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，輕輕搖動(dòng)玻片或培養(yǎng)皿等，靜置2min左右，棄去固定液，不用PBS洗而是采用空氣干燥，干燥后的標(biāo)本可于-70 長(zhǎng)期保存。解凍時(shí)要小心抗原破壞，應(yīng)先將標(biāo)本轉(zhuǎn)移于干冰預(yù)冷的固定液，然后再將混合液轉(zhuǎn)移至室溫下，固定液到達(dá)室溫時(shí)取出標(biāo)本，再用PBS沖洗，在做以后的步鄹11. 我也做過(guò)細(xì)胞爬片的組化染色，不過(guò)沒(méi)有遇到類似的問(wèn)題。細(xì)胞培養(yǎng)好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛 4度固定 15 分鐘，自然風(fēng)干。室溫保存幾周內(nèi)都可以用的。我想這可能與抗原的類型有關(guān)，有的對(duì)氧化等損傷比較敏感，

9、有的差一些。最好避光保存在4 度，同時(shí)盡量隔絕空氣。免疫熒光與普通DAB顯色差別只再二抗的標(biāo)記，樣品的保存應(yīng)該是沒(méi)有多大差別的。12. 細(xì)胞爬片丙酮固定后-20 度保存，現(xiàn)在要再做免疫熒光，將保存的爬片拿出37度復(fù)溫然后常規(guī)操作就可以了13. 爬片做免疫組化的優(yōu)勢(shì)在于抗原新鮮，細(xì)胞形態(tài)保存較好。若爬片需長(zhǎng)期保存并出現(xiàn)你這樣的問(wèn)題，原因可能是： 1) 試驗(yàn)步驟有誤，建議重復(fù)并加陽(yáng)性對(duì)照片。2) 加一抗前處理同石蠟切片，可進(jìn)行抗原修復(fù)，如胰酶消化或熱修復(fù)。3) 因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)在液相中進(jìn)行，故對(duì)已極度干燥的爬片充分水化很重要。建議試驗(yàn)前用PBS浸泡過(guò)夜。如不能解決你的問(wèn)題請(qǐng)QQ聯(lián)系： 818256

10、45。本人在湖南省腫瘤醫(yī)院病理科( 長(zhǎng)沙市 ) 做免疫組化。14. 4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用無(wú)水酒精的，固定好后放-20度，2-3 個(gè)月是沒(méi)有問(wèn)題的。15. 對(duì)于一般的細(xì)胞免疫組化，我的做法是：細(xì)胞爬片用冰的純丙酮固定20MIN，再在通風(fēng)柜將丙酮吹干，-20WORD格式度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，穿透性很強(qiáng)，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做細(xì)胞細(xì)胞爬片的固定劑。當(dāng)然還是要根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定用那種固定劑。1. 多聚甲醛 ( 常用 4%)：可用于免疫電鏡; 也可用于免疫熒光染色。主要檢測(cè)組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)

11、、主要組織相容性抗原等2. 乙醇。優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。缺點(diǎn)：但醇類對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解; 染色過(guò)程中，溫育時(shí)間長(zhǎng)，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度3. 甲醛( 福爾馬林 ) 應(yīng)用最廣優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，缺點(diǎn)：甲醛放置過(guò)久可氧化為甲酸，使溶液pH 降低，影響染色; 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰 性的染色結(jié)果。16.4 度是不能保存這么長(zhǎng)時(shí)間(1 個(gè)月 ) 的，如果抗原已被分解，再修復(fù)也沒(méi)用!17. 棄去固定液，不用PBS洗而是采用空氣干燥，干燥后的標(biāo)本可于-7

12、0 長(zhǎng)期保存。18. 爬片置于37 度PBS中洗三次，每次3 到5 秒鐘， 然后在4%多聚甲醛中固定15 分鐘，然后再用37 度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時(shí)操作過(guò)程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。載玻片上。注意一定要等中性樹(shù)膠徹底干了之后才能做后續(xù)實(shí)驗(yàn)，要不然玻片會(huì)掉下來(lái)的，就又是前功盡棄了做好的細(xì)胞爬片可以放在-20 保存?zhèn)溆茫?具體能保存多長(zhǎng)時(shí)間不太清楚，當(dāng)然盡量早用。19. 固定后放點(diǎn)PBS，然后放在4 度冰箱中保存，我最長(zhǎng)保存兩個(gè)月的，然后再做免疫組化，應(yīng)該沒(méi)有太大的問(wèn)題的。20. 固定后 4 度可以存放一周，-20 度存放半年，我現(xiàn)在也要做這個(gè)

13、，實(shí)驗(yàn)室老師教的。21. 四度放 1 周應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題的，你最好放在-20 度，我在-20 度放一個(gè)月都還出結(jié)果的. 很多人作的片子很多，不可能一次作完，一個(gè)月沒(méi)問(wèn)題.22. 最佳的固定及保存方法：(1) 中性緩沖福爾馬林( 不必調(diào) pH)：馬林 (40%甲醛，用時(shí)加入過(guò)量堿式MgCO3中和 )10.0mlNa2HPO4.12H2o1.9653g NaH2PO4.2H2O0.5460g0.85%NaCl 溶液溶解，定容至100ml。(2) 細(xì)胞固定：待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層時(shí)，用鑷子取出蓋玻片，迅速于37 PBS中漂洗 2 次，每次 3-5秒，以清除血清。(3) 將蓋玻片投入中性緩沖福爾馬林溶液中室溫固

14、定30min 。(4) 用鑷子取出蓋玻片，PBS漂洗 2 次，每次 3-5 秒， 晾干保存于 -20 備用?？砷L(zhǎng)期保存，做實(shí)驗(yàn)時(shí)，取出片子，入 PBS濕潤(rùn)后即可進(jìn)行你的實(shí)驗(yàn)。(H.E.)或免疫熒光。( 本帖沒(méi)有加分 )23. 細(xì)胞爬片固定以后要放在-20 度的冰箱 .1個(gè)月內(nèi)可以用.24. skywalkerzzwrote:過(guò)氧化氫處理這一步，用三蒸水稀釋商品濃度為30%的過(guò)氧化氫，然后室溫下玻片放在其中浸泡 10min ，是不是過(guò)氧化氫導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重脫片?/ 雙氧水，你的細(xì)胞極可能是過(guò)氧化氫導(dǎo)致嚴(yán)重脫片25. 本人比較喜歡用4%得多聚甲醛，20 分鐘很好用的。保存的時(shí)候注意片子最好晾干，不要擠

15、壓，防止粘片和碎裂。26. 細(xì)胞爬片固定好以后，如果要保存，我們的做法是倒掉固定液， PBS漂洗后干片保存在4 度，最長(zhǎng)半年沒(méi)問(wèn)題。27.1 、用新鮮配制的預(yù)冷的4%多聚甲醛緩沖液室溫固定15min， PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗滌 3 遍后是否就可以進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色了2、爬片 PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗滌 3 遍后是否能保存，怎樣保存 ?1、洗過(guò)就可以做免疫組化了。2、固定過(guò)后自然干燥，不要洗，-20 度保存。做之前再洗。28. 細(xì)胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交聯(lián)，這樣組化時(shí)不用再抗原修復(fù)。細(xì)胞固定后可室溫保存在丙酮中，不使之干燥。2

16、9. 如果是檢測(cè)膜上的物質(zhì), 好象不能用酒精,30. 適當(dāng)密度后取出固定( 丙酮 -20 固定 1020min) ，再進(jìn)行免疫染色。31. 一批細(xì)胞爬片 , 如果細(xì)胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20 分鐘，然后放 -20 度，沒(méi)有問(wèn)題。24 孔板或 6 孔板里進(jìn)行，冷丙酮會(huì)腐蝕板子，最好4%多聚甲醛。32. 細(xì)胞爬片用純丙酮固定10 分鐘，取出干燥后用錫紙包裹，-70 度保存。33. 4%多聚甲醛固定后PBS 水洗，自然干燥后用錫紙包裹，-20度凍存不超過(guò)1 月。34. 如果細(xì)胞貼壁困難，可將片子先用純血清掛一層，涼干后再養(yǎng)細(xì)胞。35.可以買 NUNC公司的專用細(xì)胞培養(yǎng)用蓋玻片，商品名Th

17、ermanox™Coverslips。高分子材料，耐高溫滅菌，經(jīng)過(guò)特殊表面處理，細(xì)胞容易貼附?？梢杂眉舻度我獠眉簦褂眯Ч?。果比玻璃蓋玻片效果好很多。36.我們通常是把細(xì)胞玻片固定好后，用PBS沖洗干凈，然后用酒精脫水(80%，90%，100%， 100%酒精各一次，每次10 分鐘左右 ) ，然后放在烘箱里烘干，這是就相當(dāng)于石蠟切片了，可以保存一定的時(shí)間?？梢缘?。免疫細(xì)胞化學(xué)染色操作規(guī)程一、材料和1、玻片：須用免疫組化專用玻片，或用處理玻片。2%多聚賴氨酸包被2、5-10%正常山羊血清封閉液，用PBS配。3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。WORD格式4、0.01

18、MPH7.4PBS5、1%BSA-PB（S 含 0.05%Tween20）6、AEC底物（ 1）底物緩沖液（20X） PH4.6醋酸（分子量60.6 ）30.6ml Triton-100醋酸鈉3H2O（分子量 136.1 ） 66.68 克加蒸餾水到960ml，調(diào) PH到 4.6 ，最后加蒸餾水到總體積1000ml（ 2） AEC（ 20X）AEC15mg/m，l溶在 DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2分子量 73.10 中）（ 3） 0.6%H2O2（ 20X）臨用時(shí)，（ 1）（ 2）（ 3）各 50ul ，在 1ml 雙蒸餾水中混勻30分鐘內(nèi)有效。7、DAB（即 DAB-4H

19、CL）（ 1） 1.5 克 DAB在 100ml 水溶液中（ 20X）（ 2） 1MTris （ 20X），用 HCL調(diào) PH到 7.4（ 1）（ 2）（ 3）各滴加入1ml 二蒸水中，新鮮配，避光， 30分鐘內(nèi)有效。溶解后（可加熱到500C），加水合氯醛50 克（水合氯醛ChloralHyclrate，分子量 165.4 ），枸櫞酸1 克，充分溶解，于棕色瓶中，室溫或40C保存。8、蘇木素復(fù)染液蘇木素1 克碘酸鈉0.2 克鉀礬50 克水1000ml9、含10%及2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液。10、3%H2O：2 30%H2O21 份，加9 份雙蒸水，臨用時(shí)配。11、細(xì)胞抗原玻片及96 孔細(xì)胞

20、抗原板（見(jiàn)ICCprotocol04）12、封片液：1 克明膠，溶于30ml350C水中，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于二、細(xì)胞內(nèi)源過(guò)氧化物酶阻斷（使用0.6ml水中）。HRP標(biāo)記二抗或SP法時(shí)必須阻斷）1、從冰箱取出細(xì)胞片或細(xì)胞板，置室溫或370C10-15分鐘，使恢復(fù)溫度。2、加 3%H2O，2 細(xì)胞片 20ul/孔，培養(yǎng)板100ul/孔，使充分覆蓋住細(xì)胞。3、室溫 10 分鐘后，甩掉H2O2，用 PBS輕輕淋洗 2 分鐘。用濾紙吸干細(xì)胞周圍水份，96 孔在濾水紙上扣干，但注意保持細(xì)胞濕潤(rùn)。三、封閉細(xì)胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/ 孔），細(xì)胞板用2-5

21、%BSA（ PBS 配制） 100ul/孔，置 370C孵育 30 分鐘后甩掉封閉液，不洗。四、免疫化學(xué)染色1、分別加一抗和所有對(duì)照一抗，細(xì)胞法10-20ul/孔，細(xì)胞板50ul/孔，使充分覆蓋細(xì)胞。371 小時(shí)或 4冰箱過(guò)夜；2、棄去一抗，如為細(xì)胞涂片用PBST輕輕簡(jiǎn)單淋洗1 次后， 浸于 100mL含 PBST洗杯，漂洗（最好在慢速搖床上）3-5分鐘，轉(zhuǎn)入第二杯PBS（1000ml），如上法漂洗 3-5分鐘。擦干細(xì)胞片周圍水分，96 孔板則倒掉一抗后，每孔加滿PBST在搖床上搖洗3-5 分鐘后倒掉，在濾紙上扣干，但保持細(xì)胞濕潤(rùn)，反復(fù)3-4 次；3、加 S.P （ S.P 法，即放大法）（

22、1）加已優(yōu)選好的濃度的Biotin標(biāo)記二抗，細(xì)胞片10ul/孔，細(xì)胞板50ul/孔，使充分復(fù)蓋細(xì)胞。 37溫和孵育30 分鐘；（ 2）按免疫化學(xué)染色“2” 所述方法洗滌和擦干；（ 3）加已優(yōu)選好濃度的S.P，用量同 “ （ 1） ” ，37孵育 30 分鐘后按免疫化學(xué)染色“2” 法洗滌及擦干；4、間接法加二抗（不放大法）方法同 S.P 法，但不用Biotin標(biāo)記二抗，而改用HRP直接標(biāo)記二抗。并省略（3）步驟；5、加底物顯色（ 1）、加足量的AEC顯色液，充分覆蓋細(xì)胞層，細(xì)胞

23、玻片20ul/孔，板 50ul/孔，置于37恒溫箱孵育5-10 分鐘，一般在顯微鏡下根據(jù)結(jié)果顏色的呈現(xiàn)情況掌握染色時(shí)間，以得到滿意的結(jié)果（陽(yáng)性對(duì)照顯色程度為“+”），用自來(lái)水即可終止反應(yīng)；（ 2）、復(fù)染：蘇木素染液（使用時(shí)間最好不超過(guò)兩個(gè)月）加蘇木素復(fù)染液1-2 滴， 1分鐘左右，在自來(lái)水龍頭下輕輕沖洗掉蘇木素，再浸于PBS中約 30 秒鐘返藍(lán)色，最后在蒸餾水中漂洗。6、封片洗后細(xì)胞片擦去周圍水分，滴加1 滴甘油明膠封片液，加蓋玻片，除去氣泡，用指甲油或樹(shù)膠封固玻片。五、結(jié)果判斷KSHV陽(yáng)性誘導(dǎo)后BCBL-1 細(xì)胞有 10%-30%顯紅色，強(qiáng)度不一，未誘導(dǎo)BCBL-1 陽(yáng)性細(xì)胞（ 1-30%）陰性誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)BCBL-1 細(xì)胞完全不顯色（排除邊緣效應(yīng)）MCMV/HVMV陽(yáng)性感染病毒的細(xì)胞有病灶反應(yīng)，顯紅色，強(qiáng)度不一，未感染細(xì)胞不顯