熒光分光光度計

1、熒光分光光度計Fluorescence Spectrometer國別廠家：日本島津公司儀器型號：RF-5301PC基本原理：主要技術(shù)指標：燈 源：150 W Xe燈單色器：閃耀式全息光柵，F(xiàn)2.5刻線1300條/mm波長范圍：220-900 nm.波長精度：土 1.5 nm,分辨率：1.0 nm狹縫寬：1.5, 3, 5, 10, 15, 20 nm靈敏度：S/N比150以上（帶寬5 nm、水拉曼峰時）測定方式：熒光光譜測定、定量測定、時間過程測定軟件功能：10通道顯示，數(shù)據(jù)RSC轉(zhuǎn)換，譜圖自動找峰，不同譜圖加減乘除，譜圖倒數(shù)、 導數(shù)、常用對數(shù)轉(zhuǎn)換等。主要功能：固體和液體的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜和

2、同步熒光光譜；熒光物質(zhì)的定量分析。使用方法:1 .將熒光光度計的右側(cè) Xe燈開關(guān)置于“ ON”的位置，再打開電源開關(guān)和電腦電源。2 .雙擊電腦上的RF-5301PC圖標，靜等儀器自檢完成，出現(xiàn)喀嚓聲后,顯示RF-5301P窗 口。3 .預熱：開機預熱20分鐘后才能進行測定工作。4 .新建文件夾：在Data文件夾里新建本次所做實驗的子文件夾5 . 啟動RF-5301PC后在Acquire Mode中選擇欲分析的項目。6 .設(shè)定參數(shù)：根據(jù)測量方式在Configure的Parameter里設(shè)定合適的參數(shù)。7 .置入樣品：將已經(jīng)裝入樣品的四面擦凈后的石英熒光比色皿放入樣品室內(nèi)試樣槽后，將蓋子蓋好。8

3、.掃描：參數(shù)設(shè)定完畢后，點擊窗口右下角的“ Start”圖標，開始才3描，掃圖結(jié)束后輸入文 件名將文件儲存。9 . 保存：在“ File”中的“ Save Channel”對曲線進行保存。10 .轉(zhuǎn)換文件：在“ File”的“Data Translation"里單擊要轉(zhuǎn)換的“ ASCH”格式或者“ DIF” 格式。11 .關(guān)機：測試完畢后，關(guān)閉電腦。之后要先關(guān)閉氤燈（Xe燈開關(guān)置于“ Off”位置），散熱20分鐘后，再關(guān)閉電源開關(guān)。注意事項：1 .開機時，請確保先開氤燈電源，再開主機電源。每次開機后請先確認一下排熱風扇工作 正常，以確保儀器正常工作，發(fā)現(xiàn)風扇有故障，應(yīng)停機檢查。2 .

4、使用石英樣品池時，應(yīng)手持其棱角處，不能接觸光面，用畢后，將其清洗干凈。3 .當操作者錯誤操作或其它干擾引起微機錯誤時，可重新啟動計算機，但無須關(guān)斷氤燈電源。4 .光學器件和儀器運行環(huán)境需保護清潔。切勿將比色皿放在儀器上。清潔儀器外表時，請勿使用乙醇乙醍等有機溶劑，請勿在工彳中清潔，不使用時請加防塵罩。5 .為延長氤燈的使用壽命，實驗完畢后要先關(guān)閉 Xe燈，不關(guān)電源主機電源（光度計的右側(cè)），等其散熱完畢后再關(guān)閉電源。工作原理熒光產(chǎn)生的原理熒光的定義：某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長較長的光。熒光產(chǎn)生的原理：化學物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其

5、從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光化合物的兩種特征光譜1 .熒光激發(fā)光譜，就是通過測量熒光體的發(fā)光通量隨波長變化而獲得的光譜，它反映 了不同波長激發(fā)光引起熒光的相對效率。2 .熒光發(fā)射光譜，如使激發(fā)光的波長和強度保持不變，而讓熒光物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光通過發(fā)射單色器后照射于檢測器上，掃描發(fā)射單色器并檢測各種波長下相應(yīng)的熒光強度，然后通過記錄儀記錄熒光強度對發(fā)射波長的關(guān)系曲線，所得到的譜圖稱為熒光光譜。物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，可以用作該物質(zhì)的定性分析。當激發(fā)光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)， 其發(fā)射光強度與溶液中該物質(zhì)的濃度成正

6、比關(guān)系，可以用作 定量分析。熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法或比色法為高，濃度太大的溶液會有自熄滅”作用，以及由于在液面附近溶液會吸收激發(fā)光，使發(fā)射光強度下降，導致發(fā)射光強度與 濃度不成正比，故熒光分析法應(yīng)在低濃度溶液中進行。熒光發(fā)射的特點：可產(chǎn)生熒光的 分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光 ；而一旦停止供 能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。溶液熒光光譜通常具有的特征：（1）斯托克斯位移：在溶液熒光光譜中，所觀察到的熒光的波長總是大于激發(fā)光的波長。（2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。（3）熒光發(fā)射光譜的形成與吸收光譜的形狀有鏡像關(guān)系熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時

7、間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式 釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）/吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān)。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（

8、熒光光譜），即在某一特定波長處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的最大吸收峰波長，且測定光波量接近于最大發(fā)射光波峰時，得到的熒光強度也最大。測量原理稀溶液 IF=2.303（）FI0 e c b,其中，I0為激發(fā)光強度；If為熒光強度；。f為熒光效率；b為液池厚度；e和C分別為發(fā)光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)和摩爾濃度。技術(shù)指標：波長掃描范圍：220-900nm波長精度：*5nm;狹縫范圍：0.15-20nm信噪比：S/N比150以上（水拉曼峰測定，狹縫 5nm）最高掃描速度：5 , 500nm/min操作規(guī)程1 .開機a.確認所測試樣液體或固體，選擇相應(yīng)的附件。b.先開啟儀器主機

9、電源，預熱半小時后啟動電腦程序RF-530XPC ,儀器自檢通過后,即可正常使用。2 .測樣（1） spectrum 模式a.在“Acquire Mode 中選擇 "Spectrum模式。對于做熒光光譜的樣品，"Configure甲“Parameters的參數(shù)設(shè)置如下：“Spectrum Type中選擇Emission;給定EX波長;給定EM的掃描范圍（最大范圍 220nm 900nm）;設(shè)定掃描速度；掃描間隔；狹縫寬度，點擊 “O觥成參數(shù)的設(shè)定。對于做激發(fā)光譜的樣品，"Configure甲“Parameters的參數(shù)設(shè)置如下:“Spectrum Type中選擇E

10、xcitation;給定EM波長;給定EX的掃描范圍(最大范圍220nm 900nm);設(shè)定掃描速度；掃描間隔；狹縫寬度，點擊 “OK完成參數(shù)的設(shè)定。b.在樣品池中放入待測的溶液，點擊“Start,'即可開始掃描。c.掃描結(jié)束后，系統(tǒng)提示保存文件?？稍?"Presentation中選擇"Graf""Radar""BothAxes Ctrl+R 來調(diào)整顯示名果范圍；在"Manipulate中選擇"Peak Pick來標出峰位，最后在"Channel中進行通道設(shè)定。d.述操作步驟對固體樣品同樣適用。(

11、2) Quantitative 模式a.在“Acquire Mode 中選擇 "Quantitative 模式。b. "Configured " Parameters 的參數(shù)設(shè)置如下：Method 選擇 "Multi Point Working Curve " ; "Order of CferVe ” "1s和"No"給定EX、EM波長;設(shè)定狹縫寬度，點擊“OK完成參數(shù)的設(shè)定。c.在樣品池中放入裝有空白溶液的比色皿后執(zhí)行"Auto Zero命令校零點。d.點擊“Standard模式，制作工作曲線

12、。e.將樣品池中的空白溶液換成一系列的已知濃度的樣品標準溶液進行測量，執(zhí)行“Rea晞令，得到相應(yīng)的熒光強度，系統(tǒng)根據(jù)測量值自動生成一條熒光強度-濃度”曲線。f.在“Presentation中選擇"Display Equation ,得到標準方程。將此工作曲線"Save"為擴展名為“.std的文件。g.工作曲線制備完畢，即可進入未知樣的測量，選擇進入“Unknown”模式，將樣品池中的已知濃度標準溶液換成待測樣品溶液，執(zhí)行"Read命令，即可得到相應(yīng)的熒光強度和相應(yīng)的濃度。將此"Save'為擴展名為“.qnim文件。(3) Time Co

13、urse 模式a.在“Acquire Mode 中選擇 "Time Course 模式。b. "Configured " Parameters 的參數(shù)設(shè)置如下：給定EX、EM波長;設(shè)定狹縫寬度；設(shè)定反應(yīng)時間；讀取速度；讀取點數(shù)；點擊“OK,完成參數(shù)的設(shè)定。c.在樣品池中放入裝有空白溶液的比色皿后執(zhí)行"Auto Zero命令校零點。d.將樣品池中的空白溶液換成待測溶液，點擊“Start,'即可開始掃描。掃描結(jié)束后，即可得到熒光強度對時間的工作曲線。e.將此工作曲線 “Save為擴展名為“.TMC的文件。3.關(guān)機退出軟件后關(guān)畢主機。注意事項a.請注意

14、愛護液體比色皿，特別是測試有機樣品的同學請在測量完畢后用有機溶劑清 洗，干燥后再放入盒子中，否則會造成比色皿表面嚴重污染，影響透光度。b.固體樣品池僅剩一個，測試完畢請物歸原處。測試完畢請注意登記，關(guān)閉儀器。分子吸收、熒光、磷光輻射躍遷無輻射躍遷一一去活化過程處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定， 通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態(tài)。這些過程包括：1）振動弛豫在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周 圍的分子，從而從高振動能層失活至低振動能層的過程，稱為振動弛豫。2）內(nèi)轉(zhuǎn)換對于具有相同多重度的分子，若較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層相重疊時，則電子可在重疊的能層之間通過振動耦合產(chǎn)生無輻射躍遷，如S2-S1;T2-T1定性分析任何熒光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜改變激發(fā)波長，測量在最強熒光發(fā)射波長處的強度變化，以激發(fā)波長對熒光強度作圖 可得到激發(fā)光譜。激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因為分子吸收光