親和層析原理和步驟

1、親親 和和 層層 析析Affinity Chromatography 一、原理一、原理n親和層析是利用生物大分子所具有的專一親和力而設(shè)計(jì)的純化技術(shù) 尋找配基配基固定化制成親和層析柱基本過(guò)程+固相化+吸附解吸+載體載體固相化 再生酶： 基質(zhì)類似物，抑制劑，輔酶抗體： 抗原，病毒，細(xì)胞細(xì)胞： 細(xì)胞表面特異蛋白，外源凝集素核酸： 互補(bǔ)堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶 激素或藥物： 受體，載體蛋白外源凝集素： 多糖，糖蛋白，細(xì)胞表面受體，細(xì)胞常見具有專一性親和力的生物分子對(duì)：常見具有專一性親和力的生物分子對(duì)：（一） 載體的選擇1、載體要求：（1）不溶性（2）滲透性：疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有良好的液 體流動(dòng)性（3）

2、化學(xué)和機(jī)械性能穩(wěn)定（4）具備大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蝕2、常用載體（1）纖維素 特點(diǎn)：價(jià)廉、來(lái)源充足 纖維性、非均一性限制大分子的摻入 非專一性吸附嚴(yán)重 用于抗體和酶的純化（2）葡聚糖凝膠特點(diǎn)： 化學(xué)及物理性質(zhì)穩(wěn)定 多孔性比瓊脂糖低（4 4）聚丙烯酰胺凝膠）聚丙烯酰胺凝膠（5 5）多孔玻璃）多孔玻璃特點(diǎn)：不受微生物的侵蝕特點(diǎn)：不受微生物的侵蝕 耐酸、堿、有機(jī)溶劑耐酸、堿、有機(jī)溶劑 表面非專一性吸附表面非專一性吸附特點(diǎn)：物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定特點(diǎn)：物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強(qiáng)抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強(qiáng) 可供化學(xué)反應(yīng)的可供化學(xué)反應(yīng)的（二）配基的選擇1、對(duì)于欲純化的物質(zhì)應(yīng)有

3、專一親和力2、必須具備能被修飾的功能基團(tuán)以酶和底物為例：以酶和底物為例：KLKL：解離常數(shù) E： 酶 L： 底物EL：復(fù)合物（三）固相化將配體以共價(jià)鍵連接于固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑n載體的排斥效應(yīng)n載體的空間障礙二、親和層析分離二、親和層析分離1、裝柱和平衡2、上樣、親和吸附3、洗脫無(wú)效洗脫無(wú)效洗脫吸附效率不高吸附效率不高有效吸附有效吸附洗脫方法（1）非特異性洗脫：改變洗脫液pH值離子強(qiáng)度梯度洗脫（2）特殊洗脫：當(dāng)?shù)鞍孜骄o密或上述方法洗脫會(huì)引起失活，可用專一的化學(xué)方法裂解配基與載體的連接鍵，再用透析或凝膠層析法去除配基。 斷鍵方法：硫酯鍵、偶氮鍵、二硫鍵（3）專一性洗脫 已使用過(guò)和柱，經(jīng)過(guò)再生處理，去除非特異吸附的雜質(zhì)后，可重復(fù)使用 再生步驟：n起始緩沖液重復(fù)平衡一次n用高離子強(qiáng)度和低離子強(qiáng)度溶液處理n用弱酸或弱堿溶液處理4、親和柱的再生：三、特點(diǎn)1、一步純化步驟2、產(chǎn)物非常純3、可從很稀的溶液中純化到所需物質(zhì)4、可去除已變性或部分降解物質(zhì)四、應(yīng)用1、分離和純化2、分辨化學(xué)或遺傳學(xué)上修飾的酶3、純化親和標(biāo)記的