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文檔簡(jiǎn)介

1、Western Blotting本次試驗(yàn)的目的是使同學(xué)們掌握 Wester n Blott ing法鑒定目標(biāo)蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法,并了解抗原抗體結(jié)合反響的影響因素。Western Blotting的blotting 譯為印跡法,是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上, 而后利用相應(yīng)的探測(cè)反響來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。1975年,Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜NC膜上,并利用DNA RNA雜交檢測(cè)特定的 DNA片段的方法,稱為 Southern印跡法。而后人們用類似的方法,對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)展印跡分析,對(duì) RNA的印跡分析稱為Northern印跡法,對(duì)單向電

2、泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為 Western印跡法,對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子 的印跡分析稱為Eastern印跡法。Western既可以定性,又可以半定量,是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法。它通常分為兩種方法:Wester n Blotti ng方法一:直接法方法二:間接法優(yōu)點(diǎn):1. 快速一種抗體2. 沒有二抗交叉反響引起的非特異性條帶1. 免特異性不受標(biāo)記影響2. 信號(hào)放大火敏度高多 個(gè)二抗結(jié)合位點(diǎn)3. 多種標(biāo)記的二抗可供 選擇4.可選擇不同的 Marker缺點(diǎn):1.免疫反響性降低1.交叉反響引起的非特2.無(wú)信號(hào)二級(jí)放大異性條帶3.抗體標(biāo)記費(fèi)時(shí)昂貴,使2.額外的二抗孵育以與用不方便條件優(yōu)

3、化同時(shí)Western又具有多種識(shí)別蛋白質(zhì)的顯色方法,主要有以下幾種:i.放 射自顯影ii.底物化學(xué)發(fā)光ECL iii.底物熒光ECF iv.底物DAB呈色現(xiàn)常 用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色。一、實(shí)驗(yàn)原理Wester n Blott ing蛋白質(zhì)免疫印跡法是將經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳奮力的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜上,固相載體以非共價(jià) 鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳別離的多肽類型與其生物學(xué)活性不變。以固相 載體上的蛋白質(zhì)為抗原,與之對(duì)應(yīng)的第一抗體發(fā)生免疫結(jié)合反響,一抗再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體發(fā)生免疫結(jié)合反響,經(jīng)過底物顯色活放射自顯影以檢查電泳別離的提議目的蛋白成分。

4、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免 疫測(cè)定特異性高、敏感等諸多優(yōu)點(diǎn),能從復(fù)雜混合物中對(duì)特定抗原進(jìn)展鑒別和定 量檢測(cè)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)和催 化劑(AP)、加速劑(TEMED聚合成的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)(凝膠。據(jù)有無(wú)濃縮效應(yīng)可將 電泳分為兩類:i. 連續(xù)系統(tǒng):緩沖液pH值、凝膠濃度一樣,帶電粒子靠電荷與分子篩效應(yīng)區(qū)分。ii.不連續(xù)系統(tǒng):緩沖離子成分、pH值、凝膠濃度不同,帶電粒子在電場(chǎng)中由電效應(yīng)、 分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)區(qū)分。SDS-PAGE的原理是:依靠SDS帶有大量負(fù)電荷來(lái)掩蓋蛋白質(zhì)外表的凈 電荷:同時(shí)由于在電泳溶液中參加了 SDS和巰

5、基乙醇,因此它還可以改變蛋白 質(zhì)構(gòu)象:在實(shí)驗(yàn)中要注意:印跡法需要較好的蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù),是蛋白質(zhì)樣品達(dá)到良好的別離效果,而且要注意膠的質(zhì)量,是蛋白質(zhì)容易轉(zhuǎn)移帶固相支持物上, 另外蛋白質(zhì)在電泳過程中別離得到的條帶被保存在膜上,在隨后的寶物階段不丟失和擴(kuò)散。免疫印跡分析之需要很小體積的時(shí)間,較短的時(shí)間過長(zhǎng),操作容易, 適用于理論和應(yīng)用上的研究。本實(shí)驗(yàn)采用人血清為材料,人類Ig根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同,分為五類:IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中IgG占血清免疫球蛋白總量的75%80%。人的IgG由兩條重鏈和兩條輕鏈組成,它們之間以二 硫鍵相連。在加SDS的電泳條件下

6、,分子中的二硫鍵被復(fù)原成游離的巰基,四 條鏈分開,重鏈遷移速度較慢,輕鏈遷移速度較快,可跑出兩條帶。對(duì)此樣品進(jìn) 展SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE丨后,用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝 酸纖維素薄膜上,用兔抗人IgG為第一抗體,用辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 為第二抗體,在過氧化物酶第五存在的情況下,檢測(cè)人的IgG。二、試劑,器材和實(shí)驗(yàn)材料【試劑】1. 30 %丙烯酰胺貯備液:29.2g丙烯酰胺,0.8g甲叉雙丙烯酰胺,加重蒸水至 100ml 。2. 濃縮膠緩沖液:0.5mol/L Tris-HCI , pH6.8。3. 別離膠緩沖液:3moI/L Tris-HCI , pH8.9 。4.

7、 10 %過硫酸銨(w/v):臨用前用蒸餾水配制。5. 10 % SDS(w/v)。6. 10 %TEMED。7. 電極緩沖液:甘氨酸 11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至 800ml , pH8.3。8. 樣品緩沖液:0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液,pH6.8 , 20 %甘油,4 % SDS, 10 % 巰基乙醇,0.005 %溴酚蘭。9. 考馬斯亮藍(lán)R250染色液:考馬斯亮藍(lán) R250 0.25g , 30%乙醇,10%冰乙 酸。10. 脫色液:乙醇6ml,冰乙酸2ml,加水至20ml。11. TBSTris-HCI,NaCI 丨緩沖液:20mmo

8、l/L Tris-HCl,12. 500mmoI/L NaCI , pH7.5,每組配 150ml。13. TTBS: 取 100mITBS,力卩 250 山 20 % Tween-20。14. 封閉液與抗體稀釋液:3 %脫脂奶粉-TBS,每組配10ml。15. 底物溶液:2.5mg二氨基聯(lián)苯胺DAB+ 10mITBS +10 pl H2O2,臨用 前配制。16. 考馬斯亮藍(lán)R250染色液:考馬斯亮藍(lán) R250 0.25g , 30%乙醇,10%冰乙 酸,總體積500ml。17. 脫色液:乙醇6ml,冰乙酸2ml,加水至20ml?!酒鞑摹?. 夾心式電泳槽2. 轉(zhuǎn)移電泳槽3. 電泳儀【實(shí)驗(yàn)材料

9、】1. 人血清2. 硝酸纖維素膜三、實(shí)驗(yàn)步驟I SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1. 灌膠前的準(zhǔn)備:將兩塊玻璃板洗凈晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干,嵌入本體的 凹槽中,長(zhǎng)玻板朝外,短玻板朝,兩塊玻璃板之間就形成了凝膠室。合上滑 塊,擰螺栓鎖緊凝膠室,檢查凝膠室底部是否與本體底端重合。然后將以上 組合放入制膠架,插入并旋轉(zhuǎn)凸輪,即可灌膠。2. 配制膠液膠液濃度%別離膠濃縮膠12%4%30%貯備液(ml)3.20.53別離膠緩沖液(ml)2一濃縮膠緩沖液(ml)一1.0重蒸水(ml)2.662.3610%SDS(ul)8040混勻后再參加以下試劑:10%TEMED(ul)804010 %過硫酸銨(ul)4020總體積

10、(ml)843. 灌 膠:將配制好的別離膠液倒入兩塊玻璃板之間的凝膠室中,待膠液加至距短玻璃板 頂端約1.5cm處時(shí)停止灌膠,然后在膠液外表上小心參 加厚約0.5cm的水層,以保持別離膠面平整,同時(shí)隔絕空氣,空氣中的氧 對(duì)凝膠的聚合有阻礙作用。待凝膠和水之間出現(xiàn)清晰界面時(shí),說明別離膠已 聚合,大約30min完成聚合。傾去別離膠上層的水,將配制好的濃縮膠液 加到別離膠上,至接近短玻璃板的頂端,插上樣品梳,放置待其聚合。4. 配制電極緩沖液:甘氨酸14.1g , SDS 0.5g,Tris 3g,加水至1000ml, pH8.3。每組配 1000ml。5. 制 樣:5山人血清,加45訕?biāo)偌?0

11、山加樣緩沖液。沸水浴加熱8 分鐘,10000rpm 離心2分鐘,取上清液作為樣品。另按說明書制備好蛋白 質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品。6. 力口 樣:1、參加電極緩沖液;a) 拔出樣品梳;b選3個(gè)樣品槽,用微量進(jìn)樣器加樣,中間槽參加 5訕分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋 白樣品,兩旁槽各參加10 d人血清樣品。 穩(wěn)壓120V電泳,當(dāng)溴酚藍(lán) 前沿到達(dá)距底部0.5cm左右時(shí),停止電泳。7. 切膠:根據(jù)切割線,先豎切后橫切,寬膠條為兩泳道,含人血清樣和分子 量標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣,考馬斯亮藍(lán) R-250全蛋白染色。窄膠條為一泳道,為人血 清樣,轉(zhuǎn)印后對(duì)目標(biāo)蛋白免疫染色。8. 膠條保存:將兩個(gè)膠條用保鮮袋包好,貼上標(biāo)有自己名字的標(biāo)簽-20 C

12、凍 存。n轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)到硝酸纖維素膜上1. 將帶有人血清和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的寬膠帶用考馬斯亮藍(lán) R250染色、脫色:將寬膠 條放到培養(yǎng)皿中,用蒸餾水清洗后,參加約10ml考馬斯亮藍(lán)R-250染色液 染色1小時(shí)左右,然后換成脫色液脫色,不時(shí)搖動(dòng)。更換幾次脫色液,至背 景無(wú)色透明,條帶清晰為止。2. 放置NC膜和膠條:a.切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素膜,用轉(zhuǎn)移緩沖液或水浸泡5min使之濕潤(rùn)。b.準(zhǔn)備2濾紙和海綿一起浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。c翻開轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移槽的膠板,依次放入:a. 一浸濕的海綿b. 一浸濕的濾紙c.用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗過的膠,并小心地趕走濾紙和膠之間的氣泡d.硝酸纖維素膜,在膜的右下角剪一小角,以標(biāo)明電

13、泳方向e. 一浸濕的濾 紙f. 一浸濕的海綿。3. 轉(zhuǎn) 移:小心地合上膠板,按膠側(cè)為負(fù)極,膜側(cè)為正極的方向放入轉(zhuǎn)移電泳 槽中,加轉(zhuǎn)移緩沖液至滿。插好轉(zhuǎn)移電泳裝置的電極,翻開電泳儀開關(guān)調(diào)至 穩(wěn)壓60V ,電泳1h,轉(zhuǎn)移完畢后翻開膠板取出硝酸纖維素薄膜。川膜的酶聯(lián)免疫染色1. 封閉:用TBS緩沖液洗膜1min后,將膜封入塑料薄膜袋,留一開口。加封 閉液1ml后封閉開口,37 C搖床上搖動(dòng)30min 。2. 加封閉液與抗體a) 與第一抗體結(jié)合(1)棄封閉液,參加適當(dāng)稀釋的1ml第一抗體溶液(兔抗人IgG),封口 后37 T搖床上輕輕搖動(dòng)50min。 取出膜,用TTBS洗膜3 次,每次1min。再封入

14、一新的塑料薄膜袋。b) 與酶標(biāo)第二抗體結(jié)合(3) 參加適當(dāng)稀釋的1ml辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG,37 °C搖床上輕輕搖動(dòng)50min。(4) 取出膜,用TTBS洗3次,每次1min,最后用TBS溶液洗1次, 以去除Tween-20 。加底物溶液顯色將膜浸入10ml底物溶液中,至顯色清楚后,用水清洗,以除去多余的底物。轉(zhuǎn)入水中保存。3. 結(jié)果分析:在凝膠成像分析系統(tǒng)上照相,并分析結(jié)果。測(cè)量分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 的遷移距離,作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,再測(cè)出硝酸纖維素膜上的人IgG帶的遷移距離, 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出人IgG重鏈的分子量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:做標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的的凝膠的總長(zhǎng)為7.53cm條帶1條帶2條帶3

15、條帶4條帶5條帶6蛋白條帶標(biāo)準(zhǔn)分子量66.245.035.25.018.414.4Mr/KDa0logMr1.821.651.51.401.261.164蛋白質(zhì)條帶遷移距離/cm1.582.413.14.185.155.827相對(duì)遷移率0.210.320.40.560. 680.772帶有人血清IgG的硝酸纖維素膜的總長(zhǎng)為7.24cmIgG輕鏈遷移距IgG輕鏈相對(duì)IgG重鏈遷移距IgG重鏈相對(duì)離/cm遷移率離/ cm遷移率數(shù)值4.080.562.380.33raD量子分?jǐn)?shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白所作標(biāo)準(zhǔn)曲線y = -1.1451X + 2.0366系列1線性系列155 Oa0.20.40.60.81相對(duì)遷移

16、率Mr由公式 y = -1.1451X + 2.0366 知:當(dāng)x重鏈相對(duì)遷移率=0.33時(shí),y=1.6587 得IgG重鏈相當(dāng)分子量為:45.57KDa當(dāng)x輕鏈相對(duì)遷移率=0.56時(shí),y=1.3953 得IgG輕鏈相當(dāng)分子量為:24.85KDa討論:一、實(shí)驗(yàn)本卷須知:1. 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有神經(jīng)毒性, 注意不要沾在皮膚上,如有沾染可 用水洗凈。聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。2. 電泳槽只能用水沖洗,不能用刷子刷,以免刷斷鉑電極絲;注意保護(hù)玻璃板。3. 一抗的選擇是影響免疫印跡成敗的主要因素。多克隆抗體結(jié)合抗原能力較且易發(fā)生強(qiáng)、靈敏度高,但易產(chǎn)生非特異性的背景;單克隆抗體識(shí)別抗原特異性

17、較好, 但可能不識(shí)別在樣品制備時(shí)因變性而失去了空間構(gòu)型的抗原表位,交叉反響。因此,兼有多克隆抗體和單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)的混合單克隆抗體近年特別被推薦,它是由一組能與抗原分子中的不同且不易變性的抗原表位結(jié)合 并不易出現(xiàn)交叉反響的單克隆抗體混合構(gòu)成。4. 如果反響靈敏度不高,可增加凝膠的厚度到1.5mm厚度超過2.0mm時(shí), 凝膠轉(zhuǎn)移效率受限;也可在電泳條帶不發(fā)生變形的前提下,盡量提高蛋白樣品的上樣量。5. 濾紙/凝膠/轉(zhuǎn)印膜/濾紙夾層組合中不能存在氣泡,可用玻璃棒在夾層組合上 滾動(dòng)將氣泡趕出,以提高轉(zhuǎn)膜效率;上下兩層濾紙不能過大,防止導(dǎo)致直接 接觸而引起短路。6. 如果出現(xiàn)非特異性的高背景,可觀察僅用

18、二抗單獨(dú)處理轉(zhuǎn)印膜所產(chǎn)生的背景 強(qiáng)度,假設(shè)高背景確由二抗產(chǎn)生,可適當(dāng)降低二抗?jié)舛然蚩s短二抗孵育時(shí)間; 并考慮延長(zhǎng)每一步的清洗時(shí)間。7. 一抗與二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)檢測(cè)不同的蛋白要求不同,須經(jīng)預(yù) 實(shí)驗(yàn)確定最正確條件。8. 一般情況使用0.45 ym的NC膜,0.10.2 ym的小孔徑膜只適合于分子量 小于20kD的蛋白質(zhì)。二、實(shí)驗(yàn)思考題:1. 12%的別離膠適合別離多少分子量圍的蛋白質(zhì)?答:由?分子克隆?中的別離膠濃度與蛋白質(zhì)分子量線性關(guān)系圖知,12%的別離膠適合別離分子量圍在15-60KDa的蛋白質(zhì)。2. 電極緩沖液中甘氨酸的作用?答:SDS-PAGE中樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液,電極液選TRIS/甘氨酸, 電

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