Real-timePCR技術(shù)介紹

1、基因的結(jié)構(gòu) 基因和基因組 基因：是合成一種功能蛋白或RNA分子所必須的全部DNA序列 一個典型的真核基因包括 編碼序列外顯子(exon)插入外顯子之間的非編碼序列內(nèi)合子(intron)5-端和3-端非翻譯區(qū)(UTR) 調(diào)控序列(可位于上述三種序列中)絕大多數(shù)真核基因是斷裂基因(split-gene)，外顯子不連續(xù)。 基因組(genome )一特定生物體的整套(單倍體)遺傳物質(zhì)的總和?；蚪M的大小用全部DNA的堿基對總數(shù)表示。人基因組3X1 09(30億bp)，共編碼約10萬個基因。每種真核生物的單倍體基因組中的全部DNA量稱為C值，與進(jìn)化的復(fù)雜性并不一致(C-Value Paradox)。真核

2、生物基因組真核生物基因組的特點(diǎn)： 真核基因組DNA在細(xì)胞核內(nèi)處于以核小體為基本單位的染色體結(jié)構(gòu)中。真核基因組中，編碼序列只占整個基因組的很小部分(23)。 基因診斷 基因診斷是通過檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病作出診斷的方法。 基因診斷的主要技術(shù)：1、核酸分子雜交2、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）3、基因芯片技術(shù)Real-time qPCR和常規(guī)PCR的區(qū)別 實(shí)時檢測（在對數(shù)擴(kuò)增時期）而不是終點(diǎn)檢測 敏感性高 需要樣品少 特異性高 精確定量 Real-time PCR概述實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒

3、光信號的積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 該技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上運(yùn)用熒光能量傳遞(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)技術(shù)，加入熒光標(biāo)記探針，巧妙地把核酸擴(kuò)增(PCR)、雜交、光譜分析和實(shí)時檢測技術(shù)結(jié)合在一起，借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物。一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實(shí)時擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)PCR的基本過程 PCR是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。它包

4、括下列三個基本步驟：1、變性（Denaturation）：待擴(kuò)增的DNA模板加熱變性成單鏈；2、退火（Annealing）：降低溫度，使單鏈靶序列與寡核苷酸引物退火；3、延伸（Extension）：在適當(dāng)條件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，產(chǎn)生新的雙鏈。上述變性、退火、延伸步驟的重復(fù)循環(huán)，導(dǎo)致特異的靶序列的指數(shù)擴(kuò)增。 PCR產(chǎn)物是介于引物的5端之間的雙鏈DNA片段。 Real-time PCR優(yōu)點(diǎn)特異性更強(qiáng)；有效解決PCR污染問題（全封閉反應(yīng)），自動化程度高； 靈敏度高； 重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，同一標(biāo)本的Ct值相同。Ct值(cycle threshold) Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光

5、信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) 。熒光閾值（threshold）的設(shè)定 PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 。同一模板在96孔PCR儀上做的96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)， 縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要 獲得未知樣品的Ct值，即可 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品 的起始拷貝數(shù)。 熒光化學(xué) 熒光

6、染料法：非飽和染料SYBRGreenI法 飽和染料LC Green法 熒光探針法： 寡核苷酸探針：TaqMan探針法TaqMan-MGB探針法 雜技探針：Molecularbeacons（分子信標(biāo)）FRET（雙雜交探針 ）SYBR Green 染料法 DNA Target SequenceDenaturation Polymerization CompletePolymerizationSYBR Green 染料法定量的特點(diǎn) 方法簡便，不需要設(shè)計探針； 成本低； 特異性低。熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽性信號。引物二聚體的

7、問題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。 飽和染料LC Green法 飽和染料LC Green法與SYBR染料法工作原理是一樣的，但與傳統(tǒng)的熒光染料 SYBR Green 相比有如下優(yōu)點(diǎn)： LC Green 染料在進(jìn)行PCR 時可以以飽和的濃度加入，不會抑制 PCR 反應(yīng)，而Sybr Green 染料濃度過高會抑制 PCR 反應(yīng)。從而，利用LC Green染料可以進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析。兩類染料法的差異 在進(jìn)行 HRM 分析時，由于飽和染料占據(jù)了 DNA 雙鏈上每一對堿基上的空位，所以在雙鏈解鏈時，染料立即與雙鏈脫離，使得熒光信號發(fā)生較大的變化，而非飽和染

8、料常發(fā)生位置上的遷移，從而對熒光信號沒有大的影響。除了LCGreen 染料外，常用的染料還有ResoLight、EverGreen等，這些都是綠色熒光染料，最佳激發(fā)波長范圍440-470nm，發(fā)射熒光波長470-520nm。下圖顯示了飽和熒光染料 LCGreen 和非飽和熒光染料 Sybr Green 的區(qū)別 ：兩類染料法的差異非飽和染料 Sybr Green 在 DNA 雙鏈熔解時會發(fā)生位置的遷移，飽和染料 LCGreen 在 DNA 雙鏈熔解時則直接從雙鏈上脫落下來。 使用飽和染料 LC Green 得到的 DNA 雙鏈熔解峰可以很明顯的將雜合子給區(qū)分出來：TaqMan 探針法 該技術(shù)的原

9、理是利用Taq酶的53外切酶活性，在傳統(tǒng)PCR技術(shù)一對特異性引物的基礎(chǔ)上增加了一條熒光雙標(biāo)記探針。該探針可與上、下游引物之間的DNA模板序列特異性結(jié)合。探針的5端標(biāo)以熒光報告基團(tuán)，3端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)。 在PCR退火復(fù)性期，探針與DNA模板特異性結(jié)合。 在PCR延伸階段，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，沿著模板合成新鏈，當(dāng)移動至探針結(jié)合的位置時便發(fā)揮其53外切酶活性將探針降解成單核苷酸，使得熒光報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，前者的熒光信號釋放并被檢測。因此，每合成一條新鏈就有一個探針被裂解并釋放出一個熒光信號。熒光信號強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量相對應(yīng)。TaqMan 探針法TaqMan -MGB探針TaqMan -M

10、GB探針 MGB探針的優(yōu)點(diǎn)探針的優(yōu)點(diǎn)：與傳統(tǒng)的TaqMan探針比較，有以下優(yōu)勢： 1. 可以使探針的長度縮短，尤其對AT含量高的序列的MGB探針的設(shè)計有很大的幫助； 2. 提高配對與非配對模板間的Tm值差異； 由于在探針的3端的Quencher基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并且與Report基團(tuán)在空間的位置更接近，使雜交的穩(wěn)定性大大提高，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更精確，分辨率更高，可以進(jìn)行SNP分析。 3. 新探針實(shí)驗(yàn)優(yōu)化步驟簡單，雜交的重復(fù)性大大提高。Molecular beacons分子信標(biāo)技術(shù)，其采用的探針在游離狀態(tài)下呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。環(huán)部的核苷酸序列與靶基因堿基序列互補(bǔ)，環(huán)兩側(cè)的莖部核苷酸序列互補(bǔ)而與靶基因序列

11、無同源性。其中環(huán)部通常含1535個堿基，而莖部長度為8個堿基左右。 探針的5端和3端分別標(biāo)以熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針游離時由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，兩基團(tuán)非常接近而形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，報告基團(tuán)的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收。在PCR變性階段該探針的莖部打開形成一條單鏈，當(dāng)溶液中存在特異性模板時，在復(fù)性階段該探針即可與模板雜交，使得5端和3端分離以至淬滅基團(tuán)對報告基團(tuán)失去抑制作用，后者的熒光信號得以釋放，其熒光強(qiáng)度也與被擴(kuò)增的模板量相對應(yīng)。 由于酶切作用的存在，分子信標(biāo)也是積累熒光 。Molecular beaconsFRET探針FRET探針又稱雙雜交探針，為羅氏發(fā)明專利。FRET 探針由兩條相

12、鄰探針組成，在一條探針的 5端標(biāo)記 FAM （羧基熒光素）熒光基團(tuán)，另一探針的3端標(biāo)記 Red 640 熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時，探針結(jié)合在模板上，F(xiàn)AM 基團(tuán)和 Red640 基團(tuán)相鄰，激發(fā) FAM 產(chǎn)生的熒光，作為 Red640 基團(tuán)的激發(fā)光被吸收，使 Red640發(fā)出波長為 640 的熒光。當(dāng)變性時，探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生 640 波長的熒光。由于 FRET 探針是靠近發(fā)光，所以檢測信號是實(shí)時信號，非累積信號。常用的熒光基團(tuán)是：LC-Red640，LC-Red705。熒光染料及探針比較熒光染料及探針比較 熒光染料及探針的簡單總結(jié)與比較：熒光染料及探針的簡單總結(jié)與比較：定量方法 標(biāo)準(zhǔn)曲

13、線法的絕對定量 標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定量 比較Ct法的相對定量 標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對定量 利用一系列稀釋度不同的已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)待測樣品的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到相應(yīng)的拷貝數(shù)。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄的RNA常作為絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備之用。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來確定。 標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定量由于在此方法中量的表達(dá)是相對于某個參照物的量而言的，因此相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線就比較容易制備，對于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只要知道其相對稀釋度即可。在整個實(shí)驗(yàn)中樣本的靶序列的量來自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照物的量，即參照物是1*的樣本，其它的樣本為參照物量的n

14、倍。在實(shí)驗(yàn)中為了標(biāo)準(zhǔn)化加入反應(yīng)體系的RNA或DNA的量，往往在反應(yīng)中同時擴(kuò)增一內(nèi)源控制物，如在基因表達(dá)研究中，內(nèi)源控制物常為一些管家基因（如-actin,3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH等）。 比較Ct法的相對定量 比較Ct法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定量的不同之處于在于其運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來計算相對量：平均相對含量平均相對含量=2-平均平均Ct 其中，其中， Ct=Ct待測待測-內(nèi)源控制物內(nèi)源控制物， Ct= Ct待測待測- Ct calibrator前提是假設(shè)每個循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到Ct值來反應(yīng)起始模板的量，一個循環(huán)（Ct=1）的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異。但是此方法是以

15、靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計。protocol對靶基因進(jìn)行Real-time PCR評價的過程： 選擇檢測方法（染料或探針）：根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)的需要。 基礎(chǔ)研究主要用SYBR Green； 探針比較特異，主要用于臨床診斷。 設(shè)計引物與探針引物與探針的設(shè)計 選擇基因的目標(biāo)區(qū)域; 選擇引物時，amplicon長度為100200bp。引物的Tm值必須比探針的Tm值低710，從而使探針與模板的結(jié)合早與引物，這對熒光的產(chǎn)生很關(guān)鍵。引物的最適Tm值是5560，長度為2025bp； 避免有二級結(jié)構(gòu)?？捎萌劢馇€觀察是否有引物二聚體； 探針的設(shè)計與引物相似； 最后

16、，用BLAST程序檢查引物、探針與其他序列的同源性。反應(yīng)體系2HotStart Mix 25l（包括Taq酶與酶的緩沖液） Primer A 0.10.5 M Primer B 0.10.5 M Probe或SYBR Green 0.10.5 M Mgcl2(25mM) 36 Mm 將以上試劑混合,再加入模板 Template DNA(50pg 500ng) 10l H2O 至50 lPCR體系中的主要成份 Taq DNA 聚合酶 是一種耐熱的DNA聚合酶，具有5-3DNA聚合酶活性，一般有5-3外切酶活性，有或無3-5外切酶活性（校對活性），無校對活性的酶在PCR中錯摻率較高。 PCR中 T

17、aq 酶的用量一般為0.5-2.5U，過多易造成非特異性擴(kuò)增，過少可能靈敏度不夠。兩步法 Cyele numberDenaturationAnnealing/Extension14050215min,9530sec,95 30sec,60存在的問題Taqman技術(shù)中Taq酶的外切酶活性能影響定量Molecular beacons技術(shù)中探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定性還不理想。熒光定量PCR技術(shù)均存在探針標(biāo)記的成本較高，不便普及的問題分析靈敏度仍需不斷提高。PCR在基因診斷中的應(yīng)用 （一）遺傳病的基因診斷目前已有近百種遺傳病可用PCR技術(shù)進(jìn)行診斷和產(chǎn)前診斷。用PCR對遺傳病進(jìn)行診斷的前提是對致病基因的結(jié)構(gòu)

18、必須部分或全部清楚。.如利用PCR-RFLP或Amp-FLP對遺傳病家系進(jìn)行連鎖分析，進(jìn)而作出基因診斷。（二）傳染病診斷PCR已應(yīng)用于多種病原體的特異性檢測和鑒定1、病毒：如HBV，HCV，HIV，HPV等。2、致病菌：如淋球菌、結(jié)核桿菌、軍團(tuán)菌、幽門螺桿菌、肺炎支原體等；（三）腫瘤基因診斷1、原癌基因和抑癌基因突變，如ras,p53；癌基因擴(kuò)增和表達(dá)分析。2、利用微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，直接診斷腫瘤，如膀胱癌等；3、分析白血病（如CML）中異常染色體易位，檢測微小殘留病變（Minimal residual disease，MDR）4、腫瘤多藥耐藥性（multi-drug resistance,MDR）檢測5、端粒酶活性檢測。 常見Real-time PCR儀生產(chǎn)商熒光定量PCR儀型號需要特殊8連管與否（相較于Axygen 0.2ml八連管）StratageneMx3000P不需要Mx3005P不需要EppendorfMastercycler ep realplex4不需要ROCHELightCycler480是，需用原裝96孔板或384孔板Bio-radCFX-960.1ml的8連管（矮管）。IQ5不需要ABIStep one/ Step one plus0.1ml的8連管（矮管）。ABI 7300/7