乙肝疫苗的生產工藝

1、 乙肝疫苗是用于預防乙肝的特殊藥物。疫乙肝疫苗是用于預防乙肝的特殊藥物。疫苗接種后，可刺激免疫系統(tǒng)產生保護性抗苗接種后，可刺激免疫系統(tǒng)產生保護性抗體，這種抗體存在于人的體液之中，乙肝體，這種抗體存在于人的體液之中，乙肝病毒一旦出現(xiàn)，抗體會立即作用，將其清病毒一旦出現(xiàn)，抗體會立即作用，將其清除，阻止感染，并不會傷害肝臟，從而使除，阻止感染，并不會傷害肝臟，從而使人體具有了預防乙肝的免疫力，從而達到人體具有了預防乙肝的免疫力，從而達到預防乙肝感染的目的。接種乙肝疫苗是預預防乙肝感染的目的。接種乙肝疫苗是預防乙肝病毒感染的最有效方法。防乙肝病毒感染的最有效方法。 基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原（Hb

2、sAg）亞單位疫苗，它系采用現(xiàn)代生物技術將乙肝病毒表達表面抗原的基因進行質粒構建，克隆進入啤酒酵母菌或CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞）中，通過培養(yǎng)這種重組酵母菌或CHO細胞來表達乙肝表面抗原亞單位。發(fā)酵后經過細胞破碎和一系列微濾、超濾、硅膠吸附、洗脫等工序，再經過疏水層析，可使產品抗原蛋白純度達99%以上。 1.目的基因的獲取 2.工程菌的構建 3.目的基因的表達 4. 蛋白質的分離純化 目的基因的獲取目的基因的獲取 編碼乙型肝炎表面抗原的基因的獲取編碼乙型肝炎表面抗原的基因的獲取 一般的目的基因的獲取方法有：一般的目的基因的獲取方法有：反轉錄法化學合成法反轉錄法化學合成法 反轉錄反轉錄聚合酶鏈

3、反應法聚合酶鏈反應法 工程菌的構建工程菌的構建 CHO(中國倉鼠卵巢）細胞的特點中國倉鼠卵巢）細胞的特點 具有準確的轉錄后修飾功能具有準確的轉錄后修飾功能 ,表達的糖基化藥表達的糖基化藥 物蛋白在分子結構、物蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最理化特性和生物學功能方面最 接近于天然蛋白分子接近于天然蛋白分子 具有產物胞外分泌功具有產物胞外分泌功 能能 ,便于下游產物分離純化便于下游產物分離純化; 具有重組基因的高效具有重組基因的高效 擴增和表達能力擴增和表達能力; 具有貼壁生長特性具有貼壁生長特性 ,且有較高的且有較高的 耐受剪切力和滲透壓能力耐受剪切力和滲透壓能力 ,可以進可以進行懸浮

4、培養(yǎng)行懸浮培養(yǎng) ,表達表達 水平較高水平較高; CHO 細胞屬于成纖維細胞細胞屬于成纖維細胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身的內源蛋很少分泌自身的內源蛋白白 ,利于外源蛋白的后分離利于外源蛋白的后分離 目的基因的表達目的基因的表達 蛋白質的分離純化蛋白質的分離純化 細胞破碎細胞破碎固液分離固液分離濃縮與初步純化濃縮與初步純化高度純化高度純化成品加工成品加工 基因工程乙肝疫苗的生產工藝包括發(fā)酵、提取、基因工程乙肝疫苗的生產工藝包括發(fā)酵、提取、純化、吸附、配制、分裝等工序。純化、吸附、配制、分裝等工序。 生產工藝中采用世界一流的發(fā)酵罐，通過全自動生產工藝中采用世界一流的發(fā)酵罐，通過全自

5、動控制，提供酵母菌最優(yōu)生長條件，發(fā)酵后經過細控制，提供酵母菌最優(yōu)生長條件，發(fā)酵后經過細胞破碎和一系列微濾、超濾、硅膠吸附、洗脫等胞破碎和一系列微濾、超濾、硅膠吸附、洗脫等工序，再經過疏水層析，可使產品抗原蛋白純度工序，再經過疏水層析，可使產品抗原蛋白純度達達99%以上以上 所有工藝設備可自動清洗、自動滅菌，有效地減所有工藝設備可自動清洗、自動滅菌，有效地減少了種種人為因素的干擾，確保生產穩(wěn)定和質量少了種種人為因素的干擾，確保生產穩(wěn)定和質量一致性。一致性。 細胞破碎細胞破碎 微濾微濾 超濾超濾 發(fā)酵結束后，通過過濾或離心，使酵母與發(fā)酵發(fā)酵結束后，通過過濾或離心，使酵母與發(fā)酵液分離，然后細胞通過高

6、壓勻漿機破碎，釋放液分離，然后細胞通過高壓勻漿機破碎，釋放出抗原。酵母的細胞壁較厚，比大腸桿菌難破出抗原。酵母的細胞壁較厚，比大腸桿菌難破碎，可在高壓勻漿機內施加幾千個大氣壓力，碎，可在高壓勻漿機內施加幾千個大氣壓力，通過針形閥突然降壓到零，使細胞破碎。通過針形閥突然降壓到零，使細胞破碎。在細在細胞破碎前加入蛋白酶抑制劑以防抗原被分解。胞破碎前加入蛋白酶抑制劑以防抗原被分解。細胞破碎后加入表面活性劑使抗原溶解。粗細胞破碎后加入表面活性劑使抗原溶解。粗細胞裂解物用細胞裂解物用0.2um0.2um中空纖維柱進行微濾。中空纖維柱進行微濾?？箍乖痛蟛糠值头肿恿克拗骷毎麅群锿ㄟ^濾原和大部分低分子量宿

7、主細胞內含物通過濾膜，細胞碎片被膜攔截。膜，細胞碎片被膜攔截。濾液再進行超濾，此時抗原被膜攔截而低分濾液再進行超濾，此時抗原被膜攔截而低分子量宿主細胞內含物通過濾膜除去。子量宿主細胞內含物通過濾膜除去。疏水柱層析疏水柱層析介質： Butyl S Sepharose FF 加入適量硫酸銨，調節(jié)電導率與柱層析平衡液電導率相等按照平衡柱床、上樣吸附、平衡液洗柱、降低硫酸銨濃度解析、清柱再生程序層析陰離子交換柱層析陰離子交換柱層析介質：DEAE Sepharose FFHBsAg活性蛋白經Sephadex G-25柱脫鹽換液，使緩沖鹽系統(tǒng)的PH、離子強度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄樣吸附、氯化鈉

8、濃度梯度分段洗脫、清柱再生程序層析凝膠過濾柱層析凝膠過濾柱層析介質：Sepharose 4 FF 超濾濃縮到適當體積按照平衡柱床、丄樣、洗脫程序層析 無菌過濾無菌過濾氫氧化鋁共沉淀氫氧化鋁共沉淀 分裝分裝純化后的抗原再與氫氧化鋁共純化后的抗原再與氫氧化鋁共沉淀，在共沉淀時，抗原吸附沉淀，在共沉淀時，抗原吸附在氫氧化鋁上。在氫氧化鋁上。疫苗的穩(wěn)定性較差，一般在疫苗的穩(wěn)定性較差，一般在28下能保存下能保存12個月，但當溫度升高后，效力很快降低。個月，但當溫度升高后，效力很快降低。在在37下，許多疫苗只能穩(wěn)定幾天或者幾下，許多疫苗只能穩(wěn)定幾天或者幾個小時，非常不利于在室溫下運輸。為了個小時，非常不利

9、于在室溫下運輸。為了使疫苗的穩(wěn)定性提高，可用凍干的方法使使疫苗的穩(wěn)定性提高，可用凍干的方法使之干燥之干燥。收取到的收取到的HBsAg除菌過濾，除菌過濾，即為純品即為純品 乙肝疫苗自乙肝疫苗自1979年問世以來，經過年問世以來，經過20多年的大規(guī)多年的大規(guī)模應用和觀察，至今尚未見到有關注射后引起嚴模應用和觀察，至今尚未見到有關注射后引起嚴重不良反應的報道，只有少數(shù)人出現(xiàn)接種部位紅重不良反應的報道，只有少數(shù)人出現(xiàn)接種部位紅腫、硬結、疼痛、手臂酸重或發(fā)熱、惡心、嘔吐、腫、硬結、疼痛、手臂酸重或發(fā)熱、惡心、嘔吐、乏力、皮疹等與一般疫苗接種大致相仿的輕微反乏力、皮疹等與一般疫苗接種大致相仿的輕微反應，多于應，多于1-3天內不治自愈。天內不治自愈。 由于乙肝疫苗屬血由于乙肝疫苗屬血源性的，在制備過程中純化與滅活程序十分嚴密，源性的，在制備過程中純化與滅活程序十分嚴密，故不會產生像破傷風等動物血清疫苗可能造成的故不會產生像破傷風等動物血清疫苗可能造成的過敏反應，也