乙肝疫苗的生產(chǎn)工藝

1、 乙肝疫苗是用于預(yù)防乙肝的特殊藥物。疫乙肝疫苗是用于預(yù)防乙肝的特殊藥物。疫苗接種后，可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性抗苗接種后，可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這種抗體存在于人的體液之中，乙肝體，這種抗體存在于人的體液之中，乙肝病毒一旦出現(xiàn)，抗體會(huì)立即作用，將其清病毒一旦出現(xiàn)，抗體會(huì)立即作用，將其清除，阻止感染，并不會(huì)傷害肝臟，從而使除，阻止感染，并不會(huì)傷害肝臟，從而使人體具有了預(yù)防乙肝的免疫力，從而達(dá)到人體具有了預(yù)防乙肝的免疫力，從而達(dá)到預(yù)防乙肝感染的目的。接種乙肝疫苗是預(yù)預(yù)防乙肝感染的目的。接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝病毒感染的最有效方法。防乙肝病毒感染的最有效方法。 基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原（Hb

2、sAg）亞單位疫苗，它系采用現(xiàn)代生物技術(shù)將乙肝病毒表達(dá)表面抗原的基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，克隆進(jìn)入啤酒酵母菌或CHO細(xì)胞（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）中，通過(guò)培養(yǎng)這種重組酵母菌或CHO細(xì)胞來(lái)表達(dá)乙肝表面抗原亞單位。發(fā)酵后經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎和一系列微濾、超濾、硅膠吸附、洗脫等工序，再經(jīng)過(guò)疏水層析，可使產(chǎn)品抗原蛋白純度達(dá)99%以上。 1.目的基因的獲取 2.工程菌的構(gòu)建 3.目的基因的表達(dá) 4. 蛋白質(zhì)的分離純化 目的基因的獲取目的基因的獲取 編碼乙型肝炎表面抗原的基因的獲取編碼乙型肝炎表面抗原的基因的獲取 一般的目的基因的獲取方法有：一般的目的基因的獲取方法有：反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈

3、反應(yīng)法聚合酶鏈反應(yīng)法 工程菌的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建 CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢）細(xì)胞的特點(diǎn)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢）細(xì)胞的特點(diǎn) 具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能 ,表達(dá)的糖基化藥表達(dá)的糖基化藥 物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最理化特性和生物學(xué)功能方面最 接近于天然蛋白分子接近于天然蛋白分子 具有產(chǎn)物胞外分泌功具有產(chǎn)物胞外分泌功 能能 ,便于下游產(chǎn)物分離純化便于下游產(chǎn)物分離純化; 具有重組基因的高效具有重組基因的高效 擴(kuò)增和表達(dá)能力擴(kuò)增和表達(dá)能力; 具有貼壁生長(zhǎng)特性具有貼壁生長(zhǎng)特性 ,且有較高的且有較高的 耐受剪切力和滲透壓能力耐受剪切力和滲透壓能力 ,可以進(jìn)可以進(jìn)行懸浮

4、培養(yǎng)行懸浮培養(yǎng) ,表達(dá)表達(dá) 水平較高水平較高; CHO 細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身的內(nèi)源蛋很少分泌自身的內(nèi)源蛋白白 ,利于外源蛋白的后分離利于外源蛋白的后分離 目的基因的表達(dá)目的基因的表達(dá) 蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎固液分離固液分離濃縮與初步純化濃縮與初步純化高度純化高度純化成品加工成品加工 基因工程乙肝疫苗的生產(chǎn)工藝包括發(fā)酵、提取、基因工程乙肝疫苗的生產(chǎn)工藝包括發(fā)酵、提取、純化、吸附、配制、分裝等工序。純化、吸附、配制、分裝等工序。 生產(chǎn)工藝中采用世界一流的發(fā)酵罐，通過(guò)全自動(dòng)生產(chǎn)工藝中采用世界一流的發(fā)酵罐，通過(guò)全自

5、動(dòng)控制，提供酵母菌最優(yōu)生長(zhǎng)條件，發(fā)酵后經(jīng)過(guò)細(xì)控制，提供酵母菌最優(yōu)生長(zhǎng)條件，發(fā)酵后經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎和一系列微濾、超濾、硅膠吸附、洗脫等胞破碎和一系列微濾、超濾、硅膠吸附、洗脫等工序，再經(jīng)過(guò)疏水層析，可使產(chǎn)品抗原蛋白純度工序，再經(jīng)過(guò)疏水層析，可使產(chǎn)品抗原蛋白純度達(dá)達(dá)99%以上以上 所有工藝設(shè)備可自動(dòng)清洗、自動(dòng)滅菌，有效地減所有工藝設(shè)備可自動(dòng)清洗、自動(dòng)滅菌，有效地減少了種種人為因素的干擾，確保生產(chǎn)穩(wěn)定和質(zhì)量少了種種人為因素的干擾，確保生產(chǎn)穩(wěn)定和質(zhì)量一致性。一致性。 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 微濾微濾 超濾超濾 發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)過(guò)濾或離心，使酵母與發(fā)酵發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)過(guò)濾或離心，使酵母與發(fā)酵液分離，然后細(xì)胞通過(guò)高

6、壓勻漿機(jī)破碎，釋放液分離，然后細(xì)胞通過(guò)高壓勻漿機(jī)破碎，釋放出抗原。酵母的細(xì)胞壁較厚，比大腸桿菌難破出抗原。酵母的細(xì)胞壁較厚，比大腸桿菌難破碎，可在高壓勻漿機(jī)內(nèi)施加幾千個(gè)大氣壓力，碎，可在高壓勻漿機(jī)內(nèi)施加幾千個(gè)大氣壓力，通過(guò)針形閥突然降壓到零，使細(xì)胞破碎。通過(guò)針形閥突然降壓到零，使細(xì)胞破碎。在細(xì)在細(xì)胞破碎前加入蛋白酶抑制劑以防抗原被分解。胞破碎前加入蛋白酶抑制劑以防抗原被分解。細(xì)胞破碎后加入表面活性劑使抗原溶解。粗細(xì)胞破碎后加入表面活性劑使抗原溶解。粗細(xì)胞裂解物用細(xì)胞裂解物用0.2um0.2um中空纖維柱進(jìn)行微濾。中空纖維柱進(jìn)行微濾。抗抗原和大部分低分子量宿主細(xì)胞內(nèi)含物通過(guò)濾原和大部分低分子量宿

7、主細(xì)胞內(nèi)含物通過(guò)濾膜，細(xì)胞碎片被膜攔截。膜，細(xì)胞碎片被膜攔截。濾液再進(jìn)行超濾，此時(shí)抗原被膜攔截而低分濾液再進(jìn)行超濾，此時(shí)抗原被膜攔截而低分子量宿主細(xì)胞內(nèi)含物通過(guò)濾膜除去。子量宿主細(xì)胞內(nèi)含物通過(guò)濾膜除去。疏水柱層析疏水柱層析介質(zhì)： Butyl S Sepharose FF 加入適量硫酸銨，調(diào)節(jié)電導(dǎo)率與柱層析平衡液電導(dǎo)率相等按照平衡柱床、上樣吸附、平衡液洗柱、降低硫酸銨濃度解析、清柱再生程序?qū)游鲫庪x子交換柱層析陰離子交換柱層析介質(zhì)：DEAE Sepharose FFHBsAg活性蛋白經(jīng)Sephadex G-25柱脫鹽換液，使緩沖鹽系統(tǒng)的PH、離子強(qiáng)度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄樣吸附、氯化鈉

8、濃度梯度分段洗脫、清柱再生程序?qū)游瞿z過(guò)濾柱層析凝膠過(guò)濾柱層析介質(zhì)：Sepharose 4 FF 超濾濃縮到適當(dāng)體積按照平衡柱床、丄樣、洗脫程序?qū)游?無(wú)菌過(guò)濾無(wú)菌過(guò)濾氫氧化鋁共沉淀氫氧化鋁共沉淀 分裝分裝純化后的抗原再與氫氧化鋁共純化后的抗原再與氫氧化鋁共沉淀，在共沉淀時(shí)，抗原吸附沉淀，在共沉淀時(shí)，抗原吸附在氫氧化鋁上。在氫氧化鋁上。疫苗的穩(wěn)定性較差，一般在疫苗的穩(wěn)定性較差，一般在28下能保存下能保存12個(gè)月，但當(dāng)溫度升高后，效力很快降低。個(gè)月，但當(dāng)溫度升高后，效力很快降低。在在37下，許多疫苗只能穩(wěn)定幾天或者幾下，許多疫苗只能穩(wěn)定幾天或者幾個(gè)小時(shí)，非常不利于在室溫下運(yùn)輸。為了個(gè)小時(shí)，非常不利

9、于在室溫下運(yùn)輸。為了使疫苗的穩(wěn)定性提高，可用凍干的方法使使疫苗的穩(wěn)定性提高，可用凍干的方法使之干燥之干燥。收取到的收取到的HBsAg除菌過(guò)濾，除菌過(guò)濾，即為純品即為純品 乙肝疫苗自乙肝疫苗自1979年問(wèn)世以來(lái)，經(jīng)過(guò)年問(wèn)世以來(lái)，經(jīng)過(guò)20多年的大規(guī)多年的大規(guī)模應(yīng)用和觀察，至今尚未見(jiàn)到有關(guān)注射后引起嚴(yán)模應(yīng)用和觀察，至今尚未見(jiàn)到有關(guān)注射后引起嚴(yán)重不良反應(yīng)的報(bào)道，只有少數(shù)人出現(xiàn)接種部位紅重不良反應(yīng)的報(bào)道，只有少數(shù)人出現(xiàn)接種部位紅腫、硬結(jié)、疼痛、手臂酸重或發(fā)熱、惡心、嘔吐、腫、硬結(jié)、疼痛、手臂酸重或發(fā)熱、惡心、嘔吐、乏力、皮疹等與一般疫苗接種大致相仿的輕微反乏力、皮疹等與一般疫苗接種大致相仿的輕微反應(yīng)，多于應(yīng)，多于1-3天內(nèi)不治自愈。天內(nèi)不治自愈。 由于乙肝疫苗屬血由于乙肝疫苗屬血源性的，在制備過(guò)程中純化與滅活程序十分嚴(yán)密，源性的，在制備過(guò)程中純化與滅活程序十分嚴(yán)密，故不會(huì)產(chǎn)生像破傷風(fēng)等動(dòng)物血清疫苗可能造成的故不會(huì)產(chǎn)生像破傷風(fēng)等動(dòng)物血清疫苗可能造成的過(guò)敏反應(yīng)，也