RT-qPCR(實時熒光定量PCR)

1、Add Your Company Slogan實時熒光定量實時熒光定量PCR技術技術RealTime QuantitativePCR南開大學醫(yī)學院南開大學醫(yī)學院 lfnn lfnnLogoLogo RT-qPCR 原理原理Contents1 RT-qPCR 步驟步驟2 SYBR 實驗步驟實驗步驟3LogoLogoRT-qPCR 原理原理1定義：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCRPCR擴增反應中擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最后通過通過Ct值和標準曲線的分析對和標準曲線的分析對起始模板進行行定量分析定量分析的方法。1.熒光原理：SYBR Green2.定量

2、原理： （1）介紹三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值 （2 2）定量原理：）定量原理： 絕對定量（標準曲線）、相對定量（絕對定量（標準曲線）、相對定量（2 2-Ct-Ct） （3 3）融解曲線）融解曲線非特異性熒光標記：非特異性熒光標記： 1 1、SYBR Green SYBR Green 結合于雙鏈結合于雙鏈DNADNA小溝之間，小溝之間，只有和雙鏈只有和雙鏈DNADNA結結合后才發(fā)熒光。（在變性過程中無熒光，在復性及合后才發(fā)熒光。（在變性過程中無熒光，在復性及延伸過程中發(fā)出熒光）延伸過程中發(fā)出熒光）RT-qPCR 原理原理-熒光原理熒光原理特異性熒光標記：特異性熒光標記： 1 1、Taq

3、Man TaqMan 水解型雜交探針。水解型雜交探針。55端標記有報告端標記有報告基團基團R R，33端標記有熒光淬滅基團端標記有熒光淬滅基團 Q Q。探針完整。探針完整，R R所發(fā)射的熒光能量被所發(fā)射的熒光能量被QQ基團吸收，無熒光?；鶊F吸收，無熒光。TaqTaq酶有酶有 53 53外切核酸酶活性，可水解探針外切核酸酶活性，可水解探針R R與與QQ分開，發(fā)出熒光。分開，發(fā)出熒光。 2 2、Molecular Beacon Molecular Beacon 分子信標。分子信標。標記熒光的發(fā)夾標記熒光的發(fā)夾探針，環(huán)與目標序列互補，莖由互補配對序列組探針，環(huán)與目標序列互補，莖由互補配對序列組成。變

4、性過程：產(chǎn)生非特異性熒光；延伸過程：成。變性過程：產(chǎn)生非特異性熒光；延伸過程：不產(chǎn)生熒光；退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測不產(chǎn)生熒光；退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號。熒光信號。 3 3、Amplisensor Amplisensor 雙鏈信號引物，進行半巢式擴增雙鏈信號引物，進行半巢式擴增；隨著；隨著PCRPCR循環(huán)的重復進行，信號引物的雙鏈結構循環(huán)的重復進行，信號引物的雙鏈結構被破壞，其中一條鏈參與到產(chǎn)物的合成中，熒光被破壞，其中一條鏈參與到產(chǎn)物的合成中，熒光消失，消失，產(chǎn)物量與熒光成反比產(chǎn)物量與熒光成反比。Q QQ QR RLogoLogoRT-qPCR 原理原理-定量原理定量原理1

5、擴增曲線圖：擴增曲線圖：橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（CycleCycle）縱坐標：熒光強度縱坐標：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集收集CtCt值的定義：值的定義：PCRPCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增過的擴增循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)。CtCt值極具重現(xiàn)性。分析定量時多取值極具重現(xiàn)性。分析定量時多取15-3515-35較好。較好。熒光信號閾值熒光信號閾值 （threshold threshold ）：）： 前前1515個循環(huán)信號作為熒光本底信號（個循環(huán)信號作為熒光本底信號（ba

6、selinebaseline），即樣本的熒光背景值和陰），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值。性對照的熒光值。熒光域值熒光域值的缺省設置是的缺省設置是3 31515個循環(huán)的熒光信號的標準偏個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的差的1010倍。倍。LogoLogoRT-qPCR 原理原理-定量原理定量原理1理想的理想的PCRPCR反應：反應： X=XX=X0 0* *2 2n n非理想的非理想的PCRPCR反應：反應： X=X0 (1+Ex)nX=X0 (1+Ex)n n n： 擴增反應的循環(huán)次數(shù)擴增反應的循環(huán)次數(shù) X X： 第第n n次循環(huán)后的產(chǎn)物量次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X X0 0：初始模板量：初始模板

7、量 Ex Ex：擴增效率：擴增效率 log log X X0 0= - log(1+Ex) = - log(1+Ex) * *CtCt+ log+ log X X Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即CtCt值值就可計算出樣品中所含的模板量.1. 1.絕對定量絕對定量LogoLogoRT-qPCR 原理原理-絕對定量絕對定量1q 模板模板DNADNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即CtCt值越小值越小q LogLog濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標

8、準曲線，根據(jù)樣品準曲線，根據(jù)樣品CtCt值，就可以計算出樣品中所含的模板量值，就可以計算出樣品中所含的模板量1. 1.絕對定量絕對定量LogoLogoRT-qPCR 原理原理-絕對定量絕對定量1R R2 2為相關系數(shù)為相關系數(shù)：R R2 20.990.99時，認為時，認為兩數(shù)值之間相關性好。兩數(shù)值之間相關性好。E E為擴增效率為擴增效率：一般認為在：一般認為在90%-90%-110%110%之間數(shù)據(jù)可用。之間數(shù)據(jù)可用。LogoLogoRT-qPCR 原理原理-相對定量相對定量12.2.相對相對定量定量病人內參病人內參基因基因病人目的病人目的基因基因對照內參對照內參基因基因對照目的對照目的基因基

9、因Ctabcd結果表示病人的目的基因的表達是對照組目的基因表達的多少倍。結果表示病人的目的基因的表達是對照組目的基因表達的多少倍。RT-qPCR 原理原理-融解曲線融解曲線溫度熒光強度Tm融融解曲線為單一峰，解曲線為單一峰，無非特異性熒光，定無非特異性熒光，定量準確。量準確。溶解峰反映反應中擴溶解峰反映反應中擴增到的產(chǎn)物的量。增到的產(chǎn)物的量。前面雜峰較多時可能原因為樣品未混勻。前面雜峰較多時可能原因為樣品未混勻。RT-qPCR 步驟步驟-SYBR Green法法1. 1.準備物品：檢測樣本、內參、引物、熒光染料、八連管、移液槍、準備物品：檢測樣本、內參、引物、熒光染料、八連管、移液槍、Real

10、plexRealplex軟件軟件2.2.將樣本等稍許離心將樣本等稍許離心3.3.加樣（可將所有共同物質加入同一管中，混勻后分散入其他管中）加樣（可將所有共同物質加入同一管中，混勻后分散入其他管中） 反應體系：反應體系： ddH2O 10L ddH2O 10L 染料染料 8L 8L 引物上下游各引物上下游各0.5L0.5L 樣本樣本 1L 1L4.4.將八連管標記后離心至無壁掛液體將八連管標記后離心至無壁掛液體5.5.將其置入將其置入RealplexRealplex儀中，儀中， 設置程序：設置程序： 95 15s 95 15s 95 15s 95 15s 57 30s 57 30s 74 30s

11、 74 30s 45 45循環(huán)，循環(huán)，ENDEND后右鍵設置后右鍵設置“insert-melting curve”“insert-melting curve”，后綠色運行，后綠色運行6 6、反應結束后將數(shù)據(jù)導出，分析數(shù)據(jù)。、反應結束后將數(shù)據(jù)導出，分析數(shù)據(jù)。反應體系的建立及優(yōu)化反應體系的建立及優(yōu)化: :1. 1.SYBR Green SYBR Green 使用濃度使用濃度: :太高抑制太高抑制TaqTaq酶活性，太低，熒光信號太弱，不酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測易檢測2.2.PrimerPrimer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準3.3.MgClMgCl2 2（多聚酶的激活劑）濃度（多聚酶的激活劑）濃度: :可以降低到可以降低到1.5mM,1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)以減少非特異性產(chǎn)物物4.4.反應反應BufferBuffer體系的優(yōu)化體系的優(yōu)化5.5.反應溫度和時間參數(shù)反應溫度和時間參數(shù): :由酶和引物決定由酶和引物決定6.6.其他與常規(guī)其他與常規(guī)PCRPCR相同相同RT-qPCR 步驟步驟-SYBR Green法法q 對對DNADNA模板沒有選擇性模板沒有選擇性 -適用于任何適用于任何DNADNAq 使用