分子生物實(shí)驗(yàn)講義（Word）

1、 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 課程講 義總學(xué)時(shí)：3216 周學(xué)時(shí)：2適用年級(jí)專(zhuān)業(yè)：生物技術(shù)2011級(jí)生物科學(xué)2010級(jí)開(kāi)課時(shí)間：20122013學(xué)年第 2學(xué)期授課教師姓名：胡凱1 / 29目錄實(shí)驗(yàn)一 基因組DNA的提取實(shí)驗(yàn)二 基因組DNA的純化實(shí)驗(yàn)三 DNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)四 DNA的瓊脂糖回收實(shí)驗(yàn)五 PCR基因的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)六 質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)七 核酸的熒光定量檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)八 大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)九 大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)一 基因組總DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理簡(jiǎn)介：抽提的DNA可用于PCR、Southern blotting、DNA文庫(kù)構(gòu)建等操作。細(xì)胞中DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，稱(chēng)核DNA或

2、染色體DNA， DNA約為109bp，如此細(xì)長(zhǎng)的分子對(duì)任何機(jī)械力的作用都十分敏感。在DNA提取過(guò)程中，DNA分子的降解很難避免，因此提取得到的只是DNA分子的片段。DNA的提取常用的有以下兩種方法：SDS（十二烷基硫酸鈉）法：高濃度的SDS在較高溫度下（55-65度）裂解細(xì)胞，破壞蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，使DNA釋放出來(lái)，通過(guò)酚和氯仿抽提去除蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖等，通過(guò)RNase A 消化去除RNA，最后用乙醇沉淀DNA。該法操作簡(jiǎn)便，能滿(mǎn)足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)需要。CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）法：CTAB是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜并能與核酸形成復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽濃度（0.7mol/L NaCl）中

3、是可溶的，通過(guò)離心就可將復(fù)合物同變性的蛋白質(zhì)、多酚、多糖雜質(zhì)（沉淀項(xiàng)）去除，水相中含有核酸與CTAB的復(fù)合物及其它可溶性的雜質(zhì)，直接向水相中加入預(yù)冷的異丙醇則導(dǎo)致核酸的沉淀，CTAB和其它多數(shù)雜質(zhì)留于異丙醇與水的混合相中，分離DNA沉淀并經(jīng)75乙醇漂洗后溶于TE （或純水）得到DNA的粗提物。用于精細(xì)PCR、Southern雜交和DNA文庫(kù)構(gòu)建的DNA則應(yīng)進(jìn)一步純化。用RNase水解RNA，用酚：氯仿：異戊醇和氯仿：異戊醇抽提去蛋白雜質(zhì)等，經(jīng)乙醇沉淀后可獲得較為純凈的植物總DNA。該法可以通過(guò)高鹽緩沖液的選擇型沉淀能很好的去除材料中的多酚及糖類(lèi)雜質(zhì)，得率高，質(zhì)量好，用于PCR、Southern

4、雜交、分子標(biāo)記、DNA文庫(kù)構(gòu)建等。二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：SDS提取液：100 m M Tris-HCl (PH 8.0)2.5%(V:V) 巰基乙醇500 m M NaCl20m M EDTA1.5% SDSCTAB抽提液：2%（w/v）CTAB100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)20 mmol/L EDTA(pH8.0)1.4 mol/L NaCl醋酸鈉：3 mol/L NaAc用冰乙酸調(diào)pH值至4.8-5.2。TE溶液：100mmol/L Tris-HCl1.00 mmol/L EDTA調(diào)pH值至8.0 。為防止Dnase的降解作用，提取使用的各種器具及溶液均應(yīng)經(jīng)過(guò)高壓滅菌。三、實(shí)

5、驗(yàn)步驟CTAB 法DNA的粗提1、加入250 mg土壤、730l 提取緩沖液、70 l裂解液和600mg 0.1mm 玻璃珠到2ml離心管中，70水浴10min。2、加入使用Tissrelyser (10min 20Hz,2次或者10min 25Hz,1次)。3、裂解管離心14000g×1分鐘,轉(zhuǎn)移上清(約600ul)到新管，加入300ul 腐植酸吸附劑和200ul 10M乙酸銨，室溫放置5min，離心14000g×5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml離心管中?！救鐦悠分懈乘岷扛撸芤侯伾^深，可加入腐殖酸吸附劑再處理一次】4、冷至室溫后加入等體積(5ml)氯仿：異

6、戊醇（24：1），輕柔顛倒混勻使乳化10min；10000轉(zhuǎn)分離心10min（18-20）；5、 吸取上清于另一干凈的2ml離心管中；注：根據(jù)需要可用氯仿：異戊醇如上法重復(fù)抽提一次；吸取上清時(shí)一定不要打破沉淀層6、 吸取上清加入與上清液等體積（約4至5ml）且已于-20預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置15分鐘至白色絮狀沉淀出現(xiàn)；注：若沒(méi)有沉淀出現(xiàn)，則加入上清液1/5至1/10體積的pH4.8-5.2的3M NaAc,混勻，于20冰箱中沉淀30min；7、 10000轉(zhuǎn)分離心10min（18-20）；棄上清，用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip頭吸干乙醇；8、 用1ml 75%乙醇再漂洗一次；

7、9、 用無(wú)水乙醇再漂洗一次；10.沉淀于室溫或60以下的恒溫箱中干燥片刻至剛出現(xiàn)半透明；用100l TE溶解沉淀，可用65水浴助溶，得DNA粗提物，可用于PCR等。實(shí)驗(yàn)二 基因組DNA的純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理簡(jiǎn)介在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，我們粗提取的需分離純化去處蛋白質(zhì)、多糖、腐殖酸等雜質(zhì)，才能獲得純度高的DNA樣品完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260,OD280的吸收值，以確定DNA的濃度和純度純化方法通常有醇沉淀、硅膠膜吸附、磁珠法等。硅膠膜在高鹽（如4M 鹽酸胍）低PH（如PH5.0-6.5）會(huì)選擇性的吸附DNA，RNA。硅膠膜在低鹽濃度高PH（如PH8.0）會(huì)釋放DNA，RNA

8、?？梢岳霉枘z膜的這個(gè)特性，達(dá)到純化DNA，RNA的目的。在磁性小球表面覆蓋能夠與DNA結(jié)合的載體分子，比如氧化硅、羧基等，利用同樣原理也可純化DNA分子。DNA的濃度可以利用自外分光光度法進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于雙鏈DNA，OD260=1.0時(shí)溶液濃度為50g/ml。DNA樣品濃度（g/l）等于OD260×N（樣品稀釋倍數(shù)）×50/1000。純的 DNA溶液其OD260/OD280應(yīng)為1.8，如果大于1.9，表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白質(zhì)或酚污染。OD260/OD230應(yīng)大于2.0，如小于2.0，表明溶液中有殘存的鹽及小分子雜質(zhì)（如核苷酸、氨基酸、酚等）。二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：2

9、ml離心管，1.5ml離心管，槍頭，硅膠膜純化柱、純化磁珠。DNA結(jié)合液：6M NaClO4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC (pH 5.2) 溴酚紅少許膜洗滌液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0 70-80% 乙醇 洗脫液：2.5mM Tris-HCl(pH8.5)或超純水（無(wú)DNA酶）  pH8.0 三、實(shí)驗(yàn)步驟DNA的硅膠膜純化1、向50ul TE溶解的DNA粗提物中入4l RNaseA；2、于65酶解RNA 30min以上；3、10000g常溫離心10min，吸取上清到新1.5ml離心管；加入200ul DNA結(jié)合液輕柔混勻，并室溫放

10、置5min。   【溶液顏色應(yīng)為黃色(pH<7)，如為紅色(pH>8)，加入10ul 3M 醋酸鈉（pH5.0)調(diào)節(jié)為黃色】4、轉(zhuǎn)移溶液到一個(gè)硅膠膜純化柱中，靜止2min,8000g離心1分鐘,將接收管中的液體重新吸取到膜中央;重復(fù)離心一次，棄掉接收管中溶液。5、加入300ulDNA結(jié)合液于純化柱中，8000g離心1分鐘。6、加入700ul洗滌液，14000g離心1分鐘，重復(fù)洗滌3次。7、將接收管中的液體倒掉，14000g離心2分鐘，去除純化柱硅膠膜中的乙醇。8、純化柱真空干燥2分鐘，將其放到一個(gè)新的1.5ml離心管中。9、加入50l 預(yù)熱的洗脫液，室

11、溫放置5min,14000g離心2分鐘。10、棄掉純化柱，1.5ml離心管中液體即為純化后DNA.DNA的磁珠純化1、向50ul TE溶解的DNA粗提物中入4l RNaseA；2、于65酶解RNA 30min以上；3、10000g常溫離心10min，吸取上清到新1.5ml離心管；加入200ul DNA結(jié)合液輕柔混勻，并室溫放置5min。   【溶液顏色應(yīng)為黃色(pH<7)，如為紅色(pH>8)，加入10ul 3M 醋酸鈉（pH5.0)調(diào)節(jié)為黃色】4、加入10ul 磁珠溶液輕柔混勻，室溫放置5ml。5、利用磁鐵分離架分離磁珠，吸取上清棄之。6、加入700

12、ul洗滌液，振蕩混勻，磁鐵分離架分離磁珠5min,吸取上清棄之。7、重復(fù)步驟6一次。8、磁珠真空干燥2分鐘，加入50ul預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min,14000g離心2分鐘。9、小心吸取上清，即為純化后DNA。兩種DNA純化方法效果比較： 將DNA粗提液、膜法純化液、磁珠法純化液分別測(cè)量紫外吸收值，比較其含量、純度，并作圖分析。實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皩?shí)驗(yàn)原理通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子的高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈

13、DNA幾乎具有等量的靜電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子，如pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（covalently closed circular DNA,簡(jiǎn)稱(chēng)CCCDNA），開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 1條鏈斷裂（open circular DNA

14、,簡(jiǎn)稱(chēng)OCDNA），線(xiàn)狀質(zhì)粒DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2條鏈發(fā)生斷裂（linear DNA, 簡(jiǎn)稱(chēng)L DNA）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移速度不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線(xiàn)狀DNA，最慢的為開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA。二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：（一）儀器1、 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、 凝膠成像系統(tǒng)或紫外投射儀（二）試劑1、 5×TBE（5倍體積的TBE貯存液）配1000ml 5×TBE：Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.0）2、 凝膠加樣緩沖液（6×）溴酚藍(lán) 0.25%蔗糖 40%

15、3、 瓊脂糖4、 溴化乙錠溶液（EB） 0.5g/ml三、實(shí)驗(yàn)步驟（一） 制備瓊脂糖凝膠按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚涵傊悄z濃度/% 線(xiàn)性DNA的有效分離范圍/kb0.3 5600.6 1200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13稱(chēng)取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30ml 0.5×TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1%瓊脂糖凝膠液，按100ml的凝膠加5l的EB。（二） 膠板的制備1、 取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干。2、 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。3、 將冷到60左

16、右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。4、 待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內(nèi)。5、 加入電泳緩沖液至電泳槽中。（三） 加樣用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品（上次實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒DNA和基因組DNA）加入加樣孔中（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。（四） 電泳1、 接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng)）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過(guò)5V/cm。2、 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。（五）、質(zhì)粒DNA的電泳分析在細(xì)胞中，共價(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed ci

17、rcular DNA,cccDNA）常常以超螺旋形式存在，如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，則形成松弛型的分子叫做開(kāi)環(huán)DNA（open circular DNA,ocDNA）.在電泳中，同一質(zhì)粒如以cccDNA形式存在，它比開(kāi)環(huán)和線(xiàn)狀DNA的泳動(dòng)速度快，因而在電泳凝膠中呈現(xiàn)三條帶（如圖）開(kāi)環(huán)DNA 線(xiàn)狀DNA超螺旋DNA 實(shí)驗(yàn)四 DNA的瓊脂糖凝膠回收一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募霸砹私釪NA片段回收的原理；學(xué)會(huì)DNA的瓊脂糖凝膠回收操作技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)所用的回收試劑的原理是在溶膠/結(jié)合液存在的條件下，使含有DNA片段的凝膠融化，使DNA片段吸附于磁珠的羧基上，通過(guò)70%乙醇洗滌后重新溶解于洗脫液中。二、

18、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備高速臺(tái)式離心機(jī) 、微量取液器；1.5，0.5和0.2ul的EP管、水浴鍋，電子秤、切下的含有回收片段的瓊脂糖凝膠 DNA結(jié)合液：6M NaClO4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC (pH 5.2) 溴酚紅少許膜洗滌液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0 70-80% 乙醇 洗脫液：2.5mM Tris-HCl(pH8.5)或超純水（無(wú)DNA酶）  pH8.0 三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 按照標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行DNA電泳，請(qǐng)使用質(zhì)量好的高熔點(diǎn)瓊脂糖，或低熔點(diǎn)瓊脂糖，使用TAE或TBE為電泳緩沖液。2. 取與樣本數(shù)相同的若干1.5ml離心管，分別稱(chēng)量后記

19、錄下重量。3. 使用插入染料如溴化乙錠對(duì)DNA進(jìn)行染色。在較長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下，用干凈的手術(shù)刀片或刮胡刀片切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠塊，盡量減小膠塊的體積。為防止DNA 損傷，要盡量縮短DNA暴露在紫外燈下的時(shí)間。將膠切片轉(zhuǎn)入已稱(chēng)重的離心管中，再稱(chēng)重后減去空管的重量，得到膠切片的重量。注意：膠切片可在4或-20于無(wú)RNA 酶的離心管中儲(chǔ)存一周，請(qǐng)務(wù)必蓋緊管蓋。4. 按照每10mg膠切片加10ul結(jié)合液的比率加足量膜結(jié)合液。5. 振蕩混合以上混合物，在50-65下孵育10分鐘，或直到膠塊完全融解。每隔幾分鐘振蕩離心管以加速膠塊的融解。室溫短暫離心，使溶液集中于管底。【溶液顏色應(yīng)為黃色(pH<

20、;7)，如為紅色(pH>8)，加入10ul 3M 醋酸鈉（pH5.0)調(diào)節(jié)為黃色】5、加入10ul 磁珠溶液輕柔混勻，室溫放置5ml。6、利用磁鐵分離架分離磁珠，吸取上清棄之。7、加入700ul洗滌液，振蕩混勻，磁鐵分離架分離磁珠5min,吸取上清棄之。8、重復(fù)步驟6一次。9、磁珠真空干燥2分鐘，加入50ul預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min,14000g離心2分鐘。10、小心吸取上清，即為回收的DNA。保存?zhèn)湎麓螌?shí)驗(yàn)用。11、檢測(cè)回收DNA的吸光度，計(jì)算其含量和純度。實(shí)驗(yàn)五 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理簡(jiǎn)介聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），即通過(guò)引物延伸核酸的某一區(qū)域而進(jìn)行的重復(fù)

21、雙向DNA合成。PCR的原理是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3端有引物存在的情況下，用酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸。多次重復(fù)的循環(huán)能使微量的模板DNA得到極大程度的擴(kuò)增。由于PCR在分子克隆和DNA分析中具有許多廣泛的用途，特別是近年來(lái)迅速出現(xiàn)了許多以PCR為基礎(chǔ)的新技術(shù)，因此，學(xué)習(xí)并盡快掌握這一門(mén)常規(guī)技術(shù)是十分必要的。影響PCR反應(yīng)的因素主要在于兩個(gè)方面：1）引物的合理設(shè)計(jì)；2）PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化。學(xué)習(xí)PCR法體外擴(kuò)增DNA的原理及操作方法；了解擴(kuò)增過(guò)程中各因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響；掌握引物設(shè)計(jì)的原則和方法。二、儀器及藥品PCR擴(kuò)增儀，PCR用薄壁管，移液槍及電泳儀等；Taq

22、DNA聚合酶，10×PCR buffer,25mmol/lMgcl2,0.225mmol/ldNTP, 10umol/l引物，模板DNA分子（0.1-2ug/ul）三、實(shí)驗(yàn)步驟1）在50 ul反應(yīng)體系中分別加入：MiniQ H2O37.5ul10×PCR buffer 5ul25mM MgCl2 3ul10mM dNTP mix 1ul引物1(10M) 1ul引物2(10M) 1ulTaq(2 to 5 units/ul) 0.5ul模板（cDNA） 1ul終體積為50 ul 注意：如果只是普通的檢測(cè)，而無(wú)須回收時(shí)，則25ul的反應(yīng)體系即可（上述體系中的各成分相應(yīng)減半）2）

23、短暫離心混勻后，放入PCR儀中，反應(yīng)程序如下：I） 943-5minII） 94 1min581min 721min30sec 30-35個(gè)循環(huán) III） 72 7-10minIV） 4 保存1） 反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物用1瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)六、質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理簡(jiǎn)介質(zhì)粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用和最基本的技術(shù)。質(zhì)粒作為載體一般要滿(mǎn)足四點(diǎn)基本的要求：1）拷貝數(shù)多；2）本身較小；3）要有較多的單一酶切位點(diǎn)；4）有易選擇的標(biāo)記如抗生素抗性基因。將細(xì)菌懸浮液暴露于高PH植的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會(huì)使細(xì)胞破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)

24、粒DNA釋放到上清中，經(jīng)管堿性溶劑使堿堿基配對(duì)完全破壞，但是閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈不會(huì)彼此分離，這是因?yàn)樵谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。只有OH出理的強(qiáng)度和時(shí)間不要太過(guò)，ph植恢復(fù)時(shí)，質(zhì)粒DNA雙鏈又形成。在裂解過(guò)程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)，破裂的細(xì)胞壁和染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型的復(fù)合物，后者被SDS包裹，當(dāng)用鉀離子取代鈉離子的時(shí)候，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來(lái)。離心除掉變性劑，就可以回收上清中的質(zhì)粒DNA了。 分離質(zhì)粒DNA的方法都包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增，收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。學(xué)習(xí)掌握質(zhì)粒的提取純化、限制性?xún)?nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳等方法和技術(shù)二、試劑配置STE：0.1M

25、 NaCl, 10mM Tris-Hcl(pH8.0), 1mM EDTA溶液I：50 mM 葡萄糖,25mM Tris-Hcl(pH8.0),10mM EDTA溶液II：0.2M NaOH,1%SDS,(注意：一定要現(xiàn)用現(xiàn)配) 溶液III（100 mM）：0.5M Kac 6.0ml,冰醋酸 11.5ml,水28.5ml氯仿：異戊醇（24：1）：24份氯仿與1份異戊醇混合均勻即可三、實(shí)驗(yàn)操作1、堿法小量制備質(zhì)粒DNAa.挑單菌落（陽(yáng)性克?。┙臃N于LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)(37,200rpm)8h，再將此活化的菌液取400ul于20ml含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中（1/50），25

26、0rpm, 37培養(yǎng)2h，即可獲得經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液；b.取1.5ml菌液，4 12000rpm，離心1min，去上清；再重懸于0.5ml STE ，4 12000rpm離心30sec，去上清；注意：去上清可采用剪去槍尖的槍頭來(lái)吸干凈c.沉淀加入100 ml 冰上預(yù)冷的“溶液 I”，劇烈震蕩重懸的菌體；d.加入200 ml 新配制的“溶液 II”，蓋緊管口，快速顛倒5次混勻，不要震蕩，確保內(nèi)表面均與溶液 II接觸，冰上3-5min；注意：該步時(shí)間切勿超過(guò)5 mine.加入150 ml 冰上預(yù)冷的“溶液 III”， 蓋緊管口，倒置試管，溫和震蕩(緩慢倒轉(zhuǎn)幾次即可)5sec，冰上5min；注意：動(dòng)作

27、要緩和，以防機(jī)械切力對(duì)DNA的斷裂作用f.4高速離心5min(13000rpm) ，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml eppendorf離心管中；g.加等體積的苯酚:氯仿（1:1），并振蕩混勻, 4, 12000 rpm離心2min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；注意：取上清時(shí)，寧可損失一部分DAN，也不要將沉淀吸入，否則會(huì)出現(xiàn)蛋白污染。為了充分的去除殘余的蛋白質(zhì)，可將此步重復(fù)一次。i.加入等體積的異丙醇（或2倍體積的無(wú)水乙醇），震蕩混勻，室溫放置2-5 min；j.4 高速離心5min去上清，倒置eppendorf管，除盡液體。加300 ml 70%的乙醇洗滌沉淀(以去掉沉淀的鹽)；k.高速離心30

28、sec，小心去掉上清；l.空氣中干燥DNA10min，加30-50 ml的TE溶液（加入的RNase終濃度為20 mg/ml）溶解沉淀，65培養(yǎng)30min去除RNA；-20保存四、注意事項(xiàng)1提取用的菌量要適量。菌體過(guò)多，導(dǎo)致所得的DNA內(nèi)雜質(zhì)較多。2提取過(guò)程中盡量在低溫條件下進(jìn)行（0或冰上操作）。3苯酚/氯仿的混合液去蛋白的效果比單獨(dú)使用酚或氯仿更好。4提取用的苯酚和氯仿要去干凈，否則會(huì)影響后面的酶切。實(shí)驗(yàn)七 核酸的熒光定量檢驗(yàn)（演示實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理熒光定量PCR最早稱(chēng)TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)

29、的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)圖。一般而言，熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DN

30、A 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值（如下圖所示）。熒光域值（threshold） 是在熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold。Ct 值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系： 研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存

31、在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值如下圖所示。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。嵌合熒光染料法（SYBR Green） SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。所以，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出線(xiàn)的雙鏈DNA量呈比列，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。SYBR Green I熒光染料與DNA雙鏈的結(jié)合 雙鏈DNA結(jié)合

32、染料的優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，僅需要2個(gè)引物，不需要設(shè)計(jì)探針，無(wú)需設(shè)計(jì)多個(gè)探針即可以快速檢驗(yàn)多個(gè)基因，且能夠進(jìn)行熔點(diǎn)曲線(xiàn)分析，檢驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，低的初始成本，通用性好，因此國(guó)內(nèi)外在科研中使用比較普遍。二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備PCR模板、Q-PCR試劑盒、引物、熒光定量PCR儀。三、實(shí)驗(yàn)操作梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的實(shí)時(shí)定量PCR1、模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3l按10倍稀釋?zhuān)铀?7l并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。2、反應(yīng)體系如下：SYBR Green 1 染料  10l上游引物F  0.5l下游

33、引物R  0.5ldNTP  0.5lTaq酶  1l模板DNA  5lddH2O  32.5l總體積  50l輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。3、制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：932分鐘，然后93 1分鐘，55 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。4、PCR產(chǎn)物在2瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。 實(shí)驗(yàn)八、感受態(tài)細(xì)胞的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募霸韺W(xué)習(xí)CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法重組DNA分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)

34、入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過(guò)程及操作統(tǒng)稱(chēng)為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。 在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進(jìn)化過(guò)程中的親緣關(guān)系，另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。 所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬(wàn)倍，而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如：電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透

35、性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。 制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無(wú)菌甘油或-70保存（有效期6個(gè)月）。 感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素1.細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度最好從-70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD600控制。對(duì)TG1菌株，OD600為05時(shí)，細(xì)胞密度在5×

36、107個(gè)/ml左右。（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過(guò)高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性?xún)?nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。2、試劑的質(zhì)量所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4。3.防止雜菌和雜DNA的污染整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。4.、整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開(kāi)冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。二、材料與試劑大腸桿菌DH5a，LB培養(yǎng)基三