ABO血型正反定型

1、ABOB型正、反定型操作規(guī)程 目的 保證 ABOto型鑒定準(zhǔn)確，確保臨床輸血安全。 適用范圍 XXX 醫(yī)院輸血科 職責(zé) 具有專業(yè)技術(shù)的工作人員主要負(fù)責(zé)本院輸血（或備血）標(biāo)本的 ABO&型鑒定（但只對該單份標(biāo)本負(fù)責(zé)）。 相關(guān)文件 試劑采購、保存和使用管理程序 設(shè)備采購、使用管理程序 消毒與清潔管理程序 標(biāo)本采集、運輸、保存和報廢管理程序 緊急用血管理程序 相關(guān)記錄 儀器設(shè)備的采購、使用和維護(hù)記錄 儀器的溫度記錄 恒溫水溫箱的換水和消毒記錄 消毒液的配置記錄 清潔消毒記錄 試劑采購、使用記錄 標(biāo)本交接和報廢記錄 緊急用血記錄 實驗原理 ABO1 型是根據(jù)紅細(xì)胞表面存在的凝集原決定的。存在

2、A 凝集原的稱為 A 型，存在 B 凝集原的稱為 B 型。而血清中還存在凝集素。當(dāng) A凝集原與抗 A凝集素相遇或 B 凝集原與抗 B凝集素相遇時，會發(fā)生紅細(xì)胞凝集反應(yīng)。一般 A 型血清中含有抗 B 凝集素，B 型血清中含有抗 A 凝集素，因此可以用標(biāo)準(zhǔn)血清中的凝集素與被測者的紅細(xì)胞反應(yīng)（稱為正定型），用標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞與被測者血清中的凝集素反應(yīng)（稱為反定型），以確定其 ABO&型。 儀器器械 玻璃試管、玻片、記號筆、一次性塑料滴管、顯微鏡、普通離心機(jī)、試管架、恒溫水溫箱、試劑保存冰箱、標(biāo)本保存冰箱。 試劑 抗 A標(biāo)準(zhǔn)血清、抗 B 標(biāo)準(zhǔn)血清、A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞、B 型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞、。型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞、生

3、理鹽水。以上試劑均為有合格證件的正品。 標(biāo)本收集與處理 1 .受檢者血清：采集受檢者靜脈血 23ml,經(jīng) 1000r/min離心 1 分鐘或室溫靜置 1 小時后取上清。 2 .25%勺受檢者紅細(xì)胞：采集受檢者靜脈血或末梢血，用生理鹽水制成 25% 紅細(xì)胞鹽水懸液備用，制備方法見本節(jié)質(zhì)量控制和注意事項。 3 .標(biāo)本出現(xiàn)中度以上溶血者，為不合格標(biāo)本，不能用于檢測。 實驗方法與步驟 血型的正定型（試管法）： 、取 2 支試管，分別標(biāo)上抗 A和抗 B; 、制備待測標(biāo)本 25%勺紅細(xì)胞懸液（取 1 支試管，加入 2ml生理鹽水，再加入 1 滴待測標(biāo)本紅細(xì)胞，混勻備用）； 、在抗 A管中加入 2 滴抗 A

4、標(biāo)準(zhǔn)血清，在抗 B 管中加入 2 滴抗 B 標(biāo)準(zhǔn)血清； 、在抗 A和抗 B 管中分別加入 1 滴已制備好的待測標(biāo)本 25%1 細(xì)胞懸液； 、混勻后，立即對稱放入離心機(jī)中進(jìn)行 1000r/min離心 1 分鐘，或室溫靜置 1 小時，再輕輕搖動試管，使沉于管底的紅細(xì)胞浮起，先肉眼觀察有無凝集現(xiàn)象，如內(nèi)眼不見凝集，應(yīng)將反應(yīng)物倒于玻片上，再以低倍鏡檢查。 根據(jù)有無凝集現(xiàn)象判定結(jié)果如下。注意凝集強(qiáng)度，此有助于 A、B 亞型、類 B 或 cisAB 的發(fā)現(xiàn)。 ABOJ1 型 抗 A標(biāo)準(zhǔn)血清 抗 B 標(biāo)準(zhǔn)血清 A型 十 一 B型 一 十 。型 一 一 AB型 十 十 凝集強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn) 4 十紅細(xì)胞凝集成一大

5、塊，血清清晰透明。 3 十紅細(xì)胞凝集成數(shù)小塊，血清尚清晰。 2 十紅細(xì)胞凝塊分散成許多小塊，見到游離紅細(xì)胞。 1 十肉眼可見大顆粒，周圍有較多游離紅細(xì)胞。 土鏡下可見數(shù)個紅細(xì)胞凝集在一起，周圍有很多游離紅細(xì)胞。 MF 混合凝集外觀（mixedfield）是指鏡下可見少數(shù)紅細(xì)胞凝集，而極大多數(shù)紅細(xì)胞仍呈分散分布。 一表示陰性，鏡下未見凝集，紅細(xì)胞均勻分布。 血型的反定型（試管法）： 、取 3 支試管，分別標(biāo)上 A、B 和 O; 、在 3 支試管中分別加入 2 滴待測標(biāo)本的血清； 、將 ABCB 準(zhǔn)紅細(xì)胞輕輕地充分混勻后，在 A管中加入 1 滴 A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞， 在 B 管中加入 1 滴 B 型標(biāo)

6、準(zhǔn)紅細(xì)胞，在。管中加入 1 滴。型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞； 、混勻后，對稱放入離心機(jī)中進(jìn)行 1000r/min 離心 1 分鐘（或 3400r/min離心 15 秒）； 、取出后，先觀察是否溶血（溶血可能是陽性結(jié)果，或者是細(xì)菌污染），再輕 輕搖動試管，肉眼觀察有無凝集現(xiàn)象，肉眼不易分辨的用顯微鏡觀察； 根據(jù)有無凝集現(xiàn)象判定結(jié)果如下。注意凝集強(qiáng)度，此有助于 A、B 亞型、類 B 或 cisAB 的發(fā)現(xiàn) ABO&型 A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞 B 型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞 O 型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞 A型 一 十 一 B型 十 一 一 。 型 十 十 一 AB型 一 一 一 凝集強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)（同 ABOB 型的試管法正定型） 質(zhì)量控制

7、和注意事項 1、分型標(biāo)準(zhǔn)血清試劑必須為三證齊全的合格產(chǎn)品，質(zhì)量性能符合要求，且在有效期內(nèi)使用。試劑開封后必須貼上注有開封日期和開封人的標(biāo)簽，使用后應(yīng)及時置于 28c 專用冰箱中保存，以免細(xì)菌污染和變質(zhì)而影響試驗結(jié)果。試劑開封后有效期為一周。 2、商用分型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞試劑必須為三證齊全的合格產(chǎn)品，質(zhì)量性能符合要求，且在有效期內(nèi)使用；自制分型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞試劑必須以 3 個健康者同型新鮮紅細(xì)胞混和，用生理鹽水洗滌 13次，以除卻存在于血清中的抗體及可溶性抗原，再制成 25%勺 紅細(xì)胞懸液備用。試劑開封或制備后必須貼上注有開封或制備日期和開封人或制備人的標(biāo)簽，使用后應(yīng)及時置于 28c 專用冰箱中保存，以免

8、細(xì)菌污染和變質(zhì)而影響試驗結(jié)果。試劑開封或制備后有效期為一周。 3、生理鹽水啟用后，有效期為二周。 4、所有試劑在使用時，必須檢查是否有渾濁、變色、凝集等變質(zhì)現(xiàn)象；凡可疑者，必須更換新的試劑進(jìn)行檢測。若分型標(biāo)準(zhǔn)血清使用時間較長后，最好用已知的 ABO 標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞檢查結(jié)果是否與已知的血型相符；若分型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞使用時間較長后，最好用已知的分型標(biāo)準(zhǔn)血清檢查結(jié)果是否與已知的血型相符，以防標(biāo)準(zhǔn)血清或紅細(xì)胞制 品污染、變質(zhì)失效而造成鑒定錯誤。 5、試管、滴管和玻片必須清潔干燥，防止溶血。 6、操作方法應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行，一般應(yīng)先加血清，后加紅細(xì)胞懸液，以便容易核實是否漏加血清。 7、IgM 抗-A和抗-B 與相應(yīng)

9、紅細(xì)胞的反應(yīng)溫度以 4c 為最強(qiáng)，但為了防止冷凝集現(xiàn)象的干擾，一般仍在室溫（2024C）內(nèi)進(jìn)行試驗，37c 可使反應(yīng)減弱。 8、離心時間不宜過長或過短，速度不宜過快或過慢，以防假陽性或假陰性結(jié)果。用試管法進(jìn)行 ABO 血型的正定型時不能測出亞型（如 A）,需延長作用時間。 9、在反定型試驗中，如果受檢者的血清或血漿與 O 型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)，則需要添加自身對照試驗。如果自身對照試驗為陽性，表明是自身冷凝集素導(dǎo)致。如果自身對照試驗為陰性，則表明被檢者血清或血漿中可能存在 ABO8 統(tǒng)以外其它系統(tǒng)的抗體干擾，此時需做其它相關(guān)試驗加以解決上述定型問題。 10、 對含有較多自身冷凝集素的受檢者，

10、 在使用標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行正定型時往往被誤定為 AB 型，遇到此種情況，需用 37c 生理鹽水洗滌受檢者的紅細(xì)胞 23 次，以去除吸附在紅細(xì)胞上的冷凝集素，然后再鑒定血型。 11、觀察時應(yīng)注意紅細(xì)胞呈特異性凝集、繼發(fā)性凝固以及緡錢狀排列的區(qū)別。對于可疑結(jié)果，必須更換所用的試劑，重新檢測。 12、對于可能存在不完全抗原的時候，應(yīng)在各反應(yīng)中加入凝聚胺試劑，以檢驗不完全抗原的存在。 13、判斷結(jié)果后應(yīng)仔細(xì)核對、記錄，避免筆誤。 14、25%!細(xì)胞懸液的配制：先用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞 3 次，再根據(jù)下表進(jìn)行紅細(xì)胞懸液的配制。 懸液濃度（ 壓積紅細(xì)胞（滴） 鹽水（滴） 2 1 40(2ml) 5 1 16 臨床

11、應(yīng)用 用于檢驗人的 ABO 血型歸屬 血型鑒定的影響因素及解決方法 準(zhǔn)確的血型鑒定是臨床安全、有效輸血的重要保證之一，但影響血型鑒定結(jié)果的因素很多。如發(fā)現(xiàn) ABOE 反定型結(jié)果不一致，應(yīng)先重復(fù)做 1 次試驗。重復(fù)做試驗時，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，使用質(zhì)量合格的試劑，并細(xì)心觀察和解釋試驗結(jié)果，就可解決明顯的問題。對一些疑難問題必須做如下進(jìn)一步研究： 1、標(biāo)本 血標(biāo)本的采集錯誤、稀釋和溶血。另從受檢者采集 l份新鮮血液標(biāo)本，這樣可以糾正因污染或搞錯樣本造成的不合。標(biāo)本一般要求離體后盡快實驗，最長不能超過3 天,每次輸血后受血者和供血者的血標(biāo)本應(yīng)在 28c 保存 7 天。 患者的藥物使用有時也對實驗有一

12、定影響，當(dāng)受血者使用肝素治療時，應(yīng)使用硫酸魚精蛋白對抗使標(biāo)本凝集；如果受血者使用右旋糖酊、聚乙烯叱咯烷酮（PVP 等治療，應(yīng)注意將紅細(xì)胞洗滌。 受檢者紅細(xì)胞上抗原位點過少（如亞型）或抗原性減弱（見于白血病或惡性月中瘤），以及類 B 或 cisAB 等。如疑為 A 抗原或 B 抗原減弱，則可將受檢紅細(xì)胞與抗一 A 或抗一 B血清做吸收及放散試驗， 以及用受檢者唾液作AB、H 血型物質(zhì)測定 （只對 80%HA明泌型的人有用）。如受檢者為 A 型血而疑為有類 B 抗原時，可用下列方法進(jìn)行鑒別：（1）觀察細(xì)胞與抗一 A及抗一 B 的凝集強(qiáng)度，與抗一 A的反應(yīng)要比與抗一 B 的反應(yīng)強(qiáng)，這種區(qū)別用玻片法作

13、試驗更為明顯；（2）用受檢者紅細(xì)胞與自身血清作試驗，血清中的抗一 B 不凝集自身紅細(xì)胞上的類 B 抗原；（3）檢查唾液中是否有 A、B 物質(zhì)，如果是分泌型，可檢出 A物質(zhì)而無 B物質(zhì)；（4）核對患者的診斷，類 B 抗原的形成與結(jié)腸癌、直腸癌、革蘭陰性桿菌感染有關(guān)。 受檢者血清中蛋白紊亂（高球蛋白血癥），或?qū)嶒灂r溫度過高，常引起紅胞呈緡錢狀排列。如試驗結(jié)果紅細(xì)胞呈緡錢狀排列，加等滲鹽水 l滴?；旌?，往往可使緡錢現(xiàn)象消失。注意不應(yīng)先加鹽水 l滴于受檢者血清中而后和紅細(xì)胞做試驗，以免使血清中抗體被稀釋。 細(xì)菌污染或遺傳因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。如發(fā)現(xiàn) 多凝集現(xiàn)象，應(yīng)考慮由遺傳產(chǎn)

14、生的 Cad 抗原活性；被細(xì)菌酶激活的 T 或 TK 受體；或產(chǎn)生機(jī)制不太明了的 Tn受體所引起。 多凝集紅細(xì)胞具有以下特點： （1） 能被人和許多家兔的血清凝集；（2）能與大多數(shù)成年人的血清凝集，不管有無相應(yīng)的同種抗體。（3） 不被臍帶血清凝集。 （4）通常不與自身的血清凝集。 （5）如有條件可用外源凝集素加以鑒別。 檢者血清中缺乏應(yīng)有的抗-A及或抗一 B 抗體，如丙種球蛋白缺乏癥，老年人血消中抗體水平大幅度下降等。如果試驗結(jié)果未見凝集，應(yīng)將細(xì)胞及血清試驗至少在室溫和 4c 放置30min,用顯微鏡檢查核實。 血清中有意外抗體，如自身抗一 I,常引起干擾。用 A1、A2、B、O 紅細(xì)胞及自身

15、紅細(xì)胞檢查受檢者血清。如果懷疑是抗一 I,用 O 型（或 AB3 目合的）臍血紅細(xì)胞檢查。 各種原因引起的紅細(xì)胞溶解，誤判為不凝集。部分溶血時，可溶性血型物質(zhì)中和了相應(yīng)的抗體。將紅細(xì)胞洗滌數(shù)次，配成 25%理鹽水細(xì)胞懸液，用抗一 A、抗一 B、抗一 Al,抗一 A十 B 及抗 H 做試驗可以得到其它有用的信息。對受檢紅細(xì)胞作直接抗球蛋白試驗，如結(jié)果呈陽性，表示紅細(xì)胞已被抗體致敏。 2、試劑 運輸、貯存等條件不適可導(dǎo)致試劑變質(zhì)失效，造成配血錯誤。實驗前進(jìn)行試劑外觀、效價等項目質(zhì)量控制。不同抗凝劑制備的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞質(zhì)量也不同；另外，紅細(xì)胞懸液過濃或過淡，抗原抗體比例不適當(dāng)，使反應(yīng)不明顯，易誤判為陰性

16、反應(yīng)。應(yīng)依據(jù)要求正確配制紅細(xì)胞濃度。分型血清效價太低、親和力不強(qiáng)，如抗一 A血清效 價不高， 可將 A亞型誤定為 O 型、 AB 型誤定為 B 型。 實驗前應(yīng)進(jìn)行試劑效價等項目質(zhì)量控制。 3 、冷凝集素 在 ABOJ1 型鑒定和交叉配血的過程中，冷凝集素是影響 ABOJ1 型正反不符和交叉配血不合的常見原因， 尤其是在冬天氣溫較低時， 某些病人血清中含有冷凝集素而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。正常人血清中冷凝集素效價一般不高，且在 4c 以下時才有活性。但 由于人免疫系統(tǒng)的差異， 在惡性月中瘤或病原體感染后有時冷反應(yīng)性自身抗體可異常增高， 造成溶血性貧血。這種冷凝集素效價在 4c 可高于 1000,用 37

17、c 生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，操作時再置于 37c 水浴中輕輕搖動可以排除冷凝集素的干擾。 4 、自身免疫性溶血性貧血 紅細(xì)胞被自身抗體強(qiáng)烈致敏后將干擾 ABOt 型，且自身抗體的存在會導(dǎo)致交叉配血不合，選擇合適的試驗方法對紅細(xì)胞上結(jié)合的抗體做放散處理，確定抗體的特異性。 如果抗體屬于同種抗體， 則交叉配血時應(yīng)選取該抗原陰性的獻(xiàn)血者的血液。 如果該抗體無法確定特異性， 則交叉配血時要根據(jù)患者自身紅細(xì)胞與自身血清的對照反應(yīng)選取較弱反應(yīng)的獻(xiàn)血者血液，因為自身抗體的干擾而發(fā)生 ABO 正反定型不相符時，可用 37c45c 生理鹽水洗滌紅細(xì)胞三次， 或者用放散后的紅細(xì)胞 （放散方法需不破壞紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)） ，血

18、清定型則可用洗滌或放散后的紅細(xì)胞將血清中的自身抗體吸收后再進(jìn)行。 5 、弱凝集 血型試驗是抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)患者紅細(xì)胞上抗原異?；蜓逯写嬖?ABCW 型以外的不規(guī)則抗體時，可能會導(dǎo)致減弱的或缺少的凝集反應(yīng)?？乖惓０ǎ簛喰?，這種亞型紅細(xì)胞抗原性較弱，可以通過亞型定型試劑來具體定型。紅細(xì)胞抗原形成不足或敏感性降低，如新生兒、老年人及少數(shù)惡病質(zhì)患者。鑒定血型時要注意正反定型的結(jié)合，加用抗 H 和抗 A,B 型標(biāo)準(zhǔn)血清、A2 紅細(xì)胞等檢查唾液中的血型物質(zhì)，必要時作吸收放散試驗以確定。若血清中存在不規(guī)則抗體可在反定型用 O 細(xì)胞加以鑒定， 有些亞型因為抗原的某些位點缺失， 也會產(chǎn)生相對于缺失抗原位點

19、的抗體， 這些抗體的產(chǎn)生有助于亞型的判定。 6 、細(xì)菌性凝集 常見有類 B 凝集， A型或 O 型病人因大腸桿菌 O86 感染， 從而使紅細(xì)胞上獲得類 B 抗原，能與抗 B 抗體發(fā)生凝集，表現(xiàn)為 B 或 AB 型。其不受溫度影響，病情好轉(zhuǎn)類 B 凝集即消失。另外紅細(xì)胞被細(xì)菌或細(xì)菌酶污染，紅細(xì)胞上的 T 抗原被激活，與供血者 中抗 T 抗體發(fā)生凝集。此種凝集在 4c 和 37c 之間隨著溫度的升高凝集程度逐漸減弱，在 37c時最弱或消失。 7 、混合外觀凝集現(xiàn)象 出現(xiàn)混合外觀凝集的情況時一般要核對標(biāo)本，必要時可重新抽取血樣?；颊咴诮谟羞^骨髓移植或輸血史、胎盤出血和白血病等應(yīng)在疾病恢復(fù)后再確定血型。其他原因如嵌合現(xiàn)象、A3 亞型及 Tn多凝集反應(yīng)等在定型時可幫助正確判斷血型。 8 、不規(guī)則抗體及亞型 血型試驗是抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)患者血清中存在 ABO1 以外的 IgM 或 IgG 和 IgM 混合型不規(guī)則抗體時，必然會導(dǎo)致 ABOE 反定型不一致?？赏ㄟ^測定唾液中的血型物質(zhì)來鑒定 ABOto型。由于受檢者紅細(xì)胞上有弱抗原，且抗原表達(dá)性特別弱，在紙片定型中很可能被錯誤定型，另外抗 A/抗 B/抗 A