實(shí)驗(yàn)三酵母核糖核酸的提取及測(cè)定(預(yù)習(xí)報(bào)告)

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告實(shí)驗(yàn)三 酵母核糖核酸的提取及測(cè)定一、研究背景RNA（核糖核酸）普遍存在于動(dòng)物、植物、微生物及某些病毒和噬菌體內(nèi)，是遺傳信息的載體，由數(shù)量不等的核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵連接而成。由于RNA在細(xì)胞內(nèi)能夠行使各種各樣的生物功能，屬酸性高分子化合物，參與蛋白質(zhì)生物合成，調(diào)控基因表達(dá)，作為核酶催化生化反應(yīng)活性，對(duì)維持生物體的正常發(fā)育有著重要作用。此外，由于RNA還具有較強(qiáng)的保濕性、抗氧化性、強(qiáng)烈的紫外光吸收性、天然助長(zhǎng)性以及抗皺防衰、防病治癌等特殊功能，1人們?cè)谘芯炕A(chǔ)理論的同時(shí)逐漸開始對(duì)RNA制劑的開發(fā)及應(yīng)用進(jìn)行探索。RNA制劑是以RNA及其衍生物為材料，經(jīng)加工制成的產(chǎn)品，主要包括

2、從富含RNA的生物體中的提取物、自溶物或者降解產(chǎn)物加工制成的各種商品。目前，人們已經(jīng)開始逐漸接受含RNA制劑的各種產(chǎn)品，需求量日益攀升，RNA制劑已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、日化、環(huán)境保護(hù)等方面，具有廣闊的商業(yè)前景，形成了一大新興產(chǎn)業(yè)。但不管是理論研究還是實(shí)際應(yīng)用，都面臨一個(gè)問題：RNA往往與細(xì)胞內(nèi)的其他化合物混在一起，離體之后穩(wěn)定性差、含量低，采用廉價(jià)、合適的手段分離純化得到RNA顯得至關(guān)重要。當(dāng)然，人們已經(jīng)摸索出來了多種多樣的方法，這些方法各有特點(diǎn)，但其基本的思路和程序大致相似，基本戰(zhàn)略也是有規(guī)律可循的。另外，近年來RNA試劑盒的出現(xiàn)使方便、快速提取純度高、完整性好的RNA分子也實(shí)現(xiàn)了可

3、能。二、研究目標(biāo)1.了解RNA制劑開發(fā)應(yīng)用的前景和基本思路；2.掌握RNA分離純化的設(shè)計(jì)思想及主要的操作細(xì)節(jié)；3.學(xué)習(xí)酵母RNA提取和測(cè)定的操作方法。三、研究策略1.選材即選取富含RNA的生物材料，微生物由于其原料易獲得性被廣泛應(yīng)用于工業(yè)上大量生產(chǎn)RNA的原料。2.提取提取RNA的方法有很多種，如濃鹽法、稀堿法、混合鹽法、苯酚法、表面活性劑法等2，但在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最多的還是稀堿法和濃鹽法。兩種方法的原理不同，濃鹽法是原理是在加熱條件下，高濃度NaCl改變細(xì)胞膜的通透性，使RNA釋放出來；稀堿法是利用堿使微生物的細(xì)胞壁溶解，釋放RNA。兩種方法各有特點(diǎn)，濃鹽法的破壁率低，但提取的RNA純度比稀

4、堿法要高；稀堿法的破壁效果好，消耗時(shí)間短，能耗低，但提取RNA純度較低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。在實(shí)際中應(yīng)根據(jù)具體情況及要求選擇合適的方法。3.提純提純過程中常需要去除的雜質(zhì)是蛋白質(zhì)。通常采用等電沉淀法使RNA沉淀出來，使其與雜質(zhì)分離，但有資料顯示該法不能有效分離RNA和蛋白質(zhì)，且RNA損失率較高。另外，也可使用鹽析法、等電沉淀法析出蛋白質(zhì)或蛋白酶降解法除去蛋白質(zhì)。4.含量測(cè)定測(cè)定RNA的含量可通過測(cè)定核糖核苷酸的糖、堿基或者磷酸來實(shí)現(xiàn)。目前有三種方法，定磷法、戊糖測(cè)定法和紫外吸收法。定磷比色法準(zhǔn)確、微量、快速，是測(cè)定RNA含量的最好方法；戊糖測(cè)定法通過糖的顏色反應(yīng)測(cè)定RNA，簡(jiǎn)單、快速，當(dāng)樣品中有粘

5、多糖和蛋白質(zhì)存在時(shí)會(huì)有干擾；紫外吸收法簡(jiǎn)單、快速、微量，但易受到蛋白質(zhì)及含有共軛雙鍵物質(zhì)的干擾。四、研究方案及可行性分析本實(shí)驗(yàn)以食品用干酵母粉為材料，采用濃鹽法提取核糖核酸并用紫外分光光度法測(cè)定制品中RNA的含量。方案合理，實(shí)驗(yàn)材料及器具實(shí)驗(yàn)室均可提供，時(shí)間上也允許，故本方案具有可行性。五、具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.實(shí)驗(yàn)儀器及試劑儀器：UV9600紫外分光光度計(jì)、JP-100架盤藥物天平、恒溫水浴鍋、TDL-40B低速離心機(jī)；器具：微量可調(diào)手動(dòng)移液器、普通大試管、25ml容量瓶、50ml容量瓶、研缽；試劑：10%NaCl溶液、6M HCl、95%乙醇、2%的氨水、RNA沉淀劑、蒸餾水；材料：食品用干酵母

6、粉。2.實(shí)驗(yàn)步驟（1）酵母核糖核酸的提取（7h）提取稱取7 g酵母粉研磨至面粉狀轉(zhuǎn)移至三角瓶，加50ml10%NaCl溶液徹底懸浮浸潤(rùn)沸水浴浸提40min提取液。分離提取液冰浴冷卻至少10min3500r/min離心30min上清液沉淀RNA上清液小燒杯中冰浴冷卻至10以下攪拌下6M HCl調(diào)節(jié)pH至2.02.5冰浴4h。洗滌純化冰浴后懸浮液3500r/min離心15minRNA沉淀約15ml95%乙醇徹底懸浮攪拌洗滌3000r/min離心10minRNA沉淀（重復(fù)洗滌、離心三次）。干燥硫酸紙于80烘箱干燥稱重邊緣折疊成框轉(zhuǎn)移RNA沉淀涂布于硫酸紙上80烘箱干燥5min稱重轉(zhuǎn)移大部分RNA制品

7、于玻璃勻漿器內(nèi)稱重剩余樣品及硫酸紙記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算純度及產(chǎn)率。（2）核糖核酸含量的測(cè)定（紫外分光光度法）（1h）勻漿液制備（15min）玻璃勻漿器內(nèi)加入5ml蒸餾水勻漿至均一的膠體溶液轉(zhuǎn)入小燒杯（10ml左右蒸餾水分次清洗并入）混勻，2%氨水調(diào)pH7.0轉(zhuǎn)入25ml容量瓶，定容，混勻含量測(cè)定（40min）取兩支試管，按下表操作管號(hào)RNA液H2O沉淀劑A5ml5mlB5ml5mlA、B管混勻冰浴20min3500r/min離心10min取上清液于兩支試管各0.5ml至兩個(gè)50ml容量瓶，定容，混勻測(cè)定樣品OD260值。（3）原始數(shù)據(jù)記錄處硫酸紙的重量（g）RNA和硫酸紙的總重量（g）剩余RNA樣品

8、及硫酸紙的總重量（g）A管的OD260值B管的OD260值（4）結(jié)果計(jì)算公式制品純度（%）=樣品OD260比消光系數(shù)×定量樣品稀釋倍數(shù)×1定量樣品重×100%產(chǎn)率：RNA提取率（%）=制品純度×總制品重7g×100%3.實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間預(yù)計(jì)本實(shí)驗(yàn)共需時(shí)間約8h。4.某些試劑與操作的作用（1）10%NaCl溶液 破除酵母菌細(xì)胞壁，釋放RNA。查閱資料顯示NaCl濃度為8%10%時(shí)RNA溶液的純度及提取率較高。（2）沸水浴浸提 對(duì)破除酵母菌細(xì)胞壁起促進(jìn)作用。破壁時(shí)的溫度對(duì)RNA提取率有很大的影響，溫度越高，越有利于細(xì)胞壁的破壞，胞內(nèi)物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)和核

9、酸）釋放的也越多?？紤]到生產(chǎn)應(yīng)用的方便性及可操作性，溫度不超過100 。（3）6M HCl調(diào)節(jié)pH至2.02.5 在核酸的等電點(diǎn)下使其盡可能多的沉淀，達(dá)到與雜質(zhì)分離的目的。（4）2%氨水調(diào)pH7.0 中性pH條件下使RNA盡可能多的溶解，從而使RNA含量測(cè)定更準(zhǔn)確。（5）測(cè)定OD260值之前將上清液稀釋100倍 高濃度有可能超出朗伯-比爾范圍，使測(cè)定結(jié)果偏差較大，稀釋后測(cè)定反而更準(zhǔn)確。5.誤差分析（1）整個(gè)實(shí)驗(yàn)中攪拌過程一定要緩慢，否則會(huì)使RNA機(jī)械破碎，影響含量測(cè)定。（2）調(diào)節(jié)等電點(diǎn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制pH。因?yàn)閜H過低會(huì)使核酸發(fā)生酸性水解，過高則核酸沉淀不完全，且會(huì)使雜質(zhì)（DNA或蛋白質(zhì)等）沉淀較

10、多。（3）紫外法測(cè)定RNA含量時(shí)，第一次定容要格外小心，切勿超過總體積（容量瓶量程小，只有25ml）。六、質(zhì)疑及相關(guān)思考1.查閱資料了解到酵母的濃度以及水浴浸提時(shí)間都會(huì)對(duì)RNA的提取率有一定的影響，大部分人得出的最適酵母濃度為10%左右（與本實(shí)驗(yàn)相差不大），而浸提時(shí)間則從25h不等（與本實(shí)驗(yàn)40min差距較大），3本實(shí)驗(yàn)浸提時(shí)間的設(shè)置是出于什么考慮？2.等電沉淀法析出RNA時(shí)蛋白質(zhì)及DNA等雜質(zhì)有多少?zèng)]有被除去（一起留在了沉淀里）？我們知道，RNA的等電點(diǎn)為2.02.5，DNA等電點(diǎn)為44.5，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)就變化很大了，我們?cè)诒ＷCRNA析出量最多的前提下，肯定會(huì)有部分的DNA及蛋白質(zhì)雜質(zhì)析出，

11、從而對(duì)RNA含量測(cè)定造成干擾。既然如此，這些雜質(zhì)對(duì)RNA含量測(cè)定的影響有多大？是否可以忽略？3.本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的是變性之后的RNA含量。我們知道，核酸變性后氫鍵和堿基堆積力受到破壞，使紫外吸收值升高，該現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。既然如此，我們?cè)?60nm波長(zhǎng)下測(cè)定的就不是酵母菌細(xì)胞RNA分子的含量。4.經(jīng)酸性乙醇沉淀的RNA，離心之后，沉積在離心杯的底部。由于沉淀較多，用95%乙醇洗滌時(shí)肯定會(huì)不充分，很多雜蛋白不易除去，形成很多粘團(tuán)，使得下面的干燥也不易操作。如果充分洗滌雜蛋白必須攪拌，這樣會(huì)使RNA 被機(jī)械破碎，影響含量測(cè)定。有實(shí)驗(yàn)顯示用苯酚-氯仿抽提法具有較好的效果，4由于酚-氯仿在水溶液中抽提蛋白，

12、作用充分，又不用劇烈振蕩，避免了RNA被機(jī)械切割，蛋白質(zhì)又能充分去除，分離得到的RNA樣品純度較高。5.關(guān)于紫外法測(cè)定RNA含量時(shí)的空白組設(shè)置。測(cè)定RNA含量時(shí)設(shè)置了A、B兩個(gè)管，分別加入蒸餾水及等量的沉淀劑，B管的作用是沉淀RNA，作為對(duì)照。應(yīng)該以蒸餾水作為空白組，分別測(cè)定A、B兩個(gè)管的OD260值，B管測(cè)定值表示除RNA以外物質(zhì)的吸光度值，A管測(cè)定值表示RNA及其他物質(zhì)的總吸光度值，以二者之差作為RNA的吸光度值。七、思考題1.作為商品開發(fā)，我們更多的是應(yīng)該考慮市場(chǎng)需求的共性還是個(gè)性？為什么？相應(yīng)的，如何完成相關(guān)欲開發(fā)產(chǎn)品的定位？更多考慮的是市場(chǎng)需求的共性。共性商品面向大眾，存在廣闊的市場(chǎng)

13、需求，具有商業(yè)前景，一旦該產(chǎn)品成功投入市場(chǎng)就可以從中挖掘出巨大的經(jīng)濟(jì)效益；相反，個(gè)性產(chǎn)品只適用于小部分人群，需求量少。若要完成相關(guān)與開發(fā)產(chǎn)品的定位，就需要進(jìn)行市場(chǎng)調(diào)查，分以下幾個(gè)方面：（1）調(diào)查該產(chǎn)品的市場(chǎng)需求量和供應(yīng)量，分析確定該產(chǎn)品目前有沒有空余市場(chǎng)，以合理設(shè)計(jì)該產(chǎn)品的產(chǎn)量；（2）調(diào)查該產(chǎn)品的具體應(yīng)用領(lǐng)域甚至該領(lǐng)域的哪一個(gè)部分，定位該產(chǎn)品的科技含量；（3）調(diào)查目前市場(chǎng)上類似的產(chǎn)品及其生產(chǎn)流程、成本、市場(chǎng)價(jià)格，要么降低成本，要么研究類似產(chǎn)品中所不具備的特性，分析開發(fā)新產(chǎn)品。2.基于生物制品的產(chǎn)業(yè)開發(fā)，探討實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)研究和大工業(yè)生產(chǎn)之間的關(guān)系和異同處？實(shí)驗(yàn)室研究往往是工業(yè)化生產(chǎn)的前體或者說基礎(chǔ)。生物制品的產(chǎn)業(yè)開發(fā)，首先是在實(shí)驗(yàn)室對(duì)某種的物質(zhì)或代謝途徑等進(jìn)行大量的研究之后，對(duì)其理化性質(zhì)、生物學(xué)功能等有了非常清楚的認(rèn)識(shí)，然后試著去尋求該物質(zhì)的應(yīng)用價(jià)值，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行小規(guī)模生產(chǎn)，最后再考慮大工業(yè)生產(chǎn)。相同點(diǎn)：都需要從原料開始去探索相關(guān)的生產(chǎn)流程，以得到最終的產(chǎn)品。不同點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)室研究設(shè)備的容量很小，很難對(duì)大型工業(yè)設(shè)備中必然出現(xiàn)的許多工程因素（如傳熱、傳質(zhì)、流動(dòng)與混合等）作充分考察；此外，在連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的工業(yè)化生產(chǎn)上，還要保證設(shè)備的穩(wěn)定和工藝的重現(xiàn)性；最后，工業(yè)化生產(chǎn)還要考慮成本、市場(chǎng)需求等客觀存在的實(shí)際問題，因?yàn)楣I(yè)化生產(chǎn)追求的還是經(jīng)濟(jì)效益