食物總抗氧化能力TAC熒光法ORAC定量檢測試劑盒

1、食物總抗氧化能力（TAC ）熒光法（ ORAC ）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）主要用途食物總抗氧化能力（ TAC）熒光法（ ORAC ）定量檢測試劑是一種旨在通過使用熒光素探針，受到有機氮自由基 AAPH 的破壞，但在抗氧化劑的存在下，得到抑制，由此通過熒光分光光度儀，觀察其峰值下降程度的變化，來定量檢測對應(yīng)于標準水溶性生育酚Trolox 的總抗氧化能力，即消除自由基等值濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種新鮮食物樣品總抗氧化能力檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定。技術(shù)背景超氧自由基陰離子（superoxide radical； O2-

2、 ）、過氧化氫（ hydrogen peroxide ； H2O2 ）、羥自由基或氫氧基（ hydroxyl radical ；OH -）、過氧化基（ peroxyl radical ；ROO -）、氫過氧自由基（ hydroperoxyl ；HOO ）、烷氧自由基（ alcoxyl radical ）、氮氧基（ nitric Oxide ；NO- ）、過氧亞硝基陰離子（ peroxynitrite anion ；ONOO -）次氯酸（ hypochlorous acid； HOCl ）、半醌自由基（ semiquinone radical ）、單線態(tài)氧氣（ singlet oxygen ）等

3、細胞內(nèi)活性氧族（ Reactive Oxygen Species； ROS）的產(chǎn)生和增多，將導致細胞衰老或凋亡，甚而導致諸如冠心病、風濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統(tǒng)內(nèi)，通過抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍蛋白（ceruloplasmin； CER）、鐵蛋白（ ferritin ）和抗氧化因子，例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素（bilirubin ）等，產(chǎn)生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達到消除或降低ROS的損害。通過氧自由基吸光能力（ oxygen radical absorbance

4、capacity； ORAC ），即使用熒光素（ fluorescein ）作為探針， 2,2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽 （ 2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride ；AAPH ）作為過氧自由基供體 （peroxyl radical donor），其攻擊探針，產(chǎn)生熒光淬滅，一旦受到抗氧化劑作用，而防止熒光消失，由此評價抗氧化潛力和活性，也就是自由基去除作用（free radical scavenging），在熒光分光光度儀（激發(fā)波長485nm20，散發(fā)波長528nm 20）的幫助下，觀察其峰值下降程度的變化，并與標準化抗氧化劑水溶性生育酚Trol

5、ox 對照。產(chǎn)品內(nèi)容清理液（ Reagent A）500毫升緩沖液（ Reagent B）4毫升染色液（ Reagent C）7.5 毫升氧化液（ Reagent D）1管標準液（ Reagent E）200微升產(chǎn)品說明書1 份保存方式保存清理液（ Reagent A）和 緩沖液（ Reagent B）在 4冰箱里，其余的保存在20冰箱里，避免光照；有效保證 6 月用戶自備50 毫升燒杯：用于樣品操作的容器15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器1.5 毫升離心管：用于標準樣品配制的容器4臺式離心機：用于樣品操作200 微升 1 厘米光徑比色皿或黑色96 孔板：用于熒光分析的容器熒光分光光度儀

6、或熒光酶標儀：用于熒光分析實驗步驟一、 樣品準備1、固態(tài)食品處理1 秤取 1 克固態(tài)食品或粉末到50 毫升燒杯，杯口封口膜密封2 加入 8 毫升清理液（ Reagent A）3 攪拌 30 分鐘，充分混勻4 繼續(xù)加入清理液（ Reagent A）到終容量為10 毫升5 過濾紙過濾，去除不溶性固體顆粒6 封口膜封口備用2、液態(tài)食品處理1 移取 5 毫升待測液態(tài)食品到15 毫升錐形離心管2 放進臺式離心機離心10 分鐘，速度為1500g3 移取上清液到新的15 毫升錐形離心管4 （選擇步驟）可以加入適量的清理液（ Reagent A）5 （選擇步驟）過濾紙過濾（如果離心處理，樣品仍然不清澈）6 置

7、于冰槽里備用或放進-20 冰箱里保存二、標準液準備1 準備好 5個 1.5 毫升離心管，標記為1至5號管2 分別加入50微升 緩沖液（ Reagent B）到 2 至 5 號管3 移取 100 微升 標準液（ Reagent E）到 1 號管，混勻4 小心移取50微升 1號管的 標準液（ Reagent E）到 2 號管，混勻5 小心移取50微升 2號管稀釋的標準液（ Reagent E）到 3 號管，混勻6 小心移取50微升 3號管稀釋的標準液（ Reagent E）到 4 號管，混勻7 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表管號緩沖液（ Reagent B）標準液（ Rea

8、gent E）測定體系標準 Trolox 濃度10100 微升1 微摩爾 /升250 微升50 微升0.5 微摩爾 /升350 微升50 微升0.25 微摩爾 / 升450 微升50 微升0.125 微摩爾 / 升550微升00三、 樣品測讀實驗開始前，將 20冰箱里的試劑置于室溫下融化，移取 1.5 毫升 緩沖液（ Reagent B）到（Reagent D）里，混勻，置于暗室里，標記為 氧化工作液 ，避免光照。然后進行下列操作。1管 氧化液1準備 1 個黑色 96 孔板，做好標記：最大對照孔、標準樣品孔、待測樣品孔2分別移取 150 微升染色液（ Reagent C）到黑色 96 孔板里的

9、每個孔里3加入 25 微升 緩沖液（ Reagent B）到最大對照孔4加入 25 微升上述配制的標準液（ Reagent E ）到相應(yīng)標準樣品孔里5加入 25 微升樣品（ 100 微克食品總量）到待測樣品孔里6放進 37培養(yǎng)箱里孵育30 分鐘7分別加入 25 微升 氧化工作液 到標準樣品孔和待測樣品孔里8加入 25 微升 緩沖液（ Reagent B）到最大對照孔9輕輕搖動黑色96 孔板，使其混勻10 放進 37培養(yǎng)箱里孵育15 分鐘11 即刻放進熒光分光光度儀或熒光酶標儀里測讀：激發(fā)波長485nm20，散發(fā)波長12 分析結(jié)果：1）構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y 軸）為熒光單位；橫座標（X 軸）為

10、標準升）2）最大對照孔為最大熒光單位讀數(shù)3）標準樣品孔和待測樣品孔為實際熒光單位讀數(shù)4）根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)Trolox 濃度（微摩爾 /升）5）計算樣品實際總抗氧化能力528nm20Trolox 濃度（微摩爾/【根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)（樣品容量；毫升）（微摩爾Trolox 濃度（微摩爾 /升）X 0.2（體系容量； 毫升）/升 TROLOX 等值）X樣品稀釋倍數(shù)】 0.0256）根據(jù)下列公式計算測定體系中樣品量的總抗氧化能力（實際抑制百分率）【實際熒光單位讀數(shù)最大對照孔熒光單位讀數(shù)】X 100 7）IC50 ：50抑制率所需的樣品單位：TROLOX 等值或樣品重量 （毫克 /毫升）或樣品容量 （微升）X （所需樣品單位）（已知樣品單位實際抑制百分率）X 50 注意事項1 本產(chǎn)品為 50 次操作，包括標準品2 本產(chǎn)品測試范圍為100 納摩爾至 1 微摩爾 Trolox 等值3 操作時，須戴手套4 樣品制備的所有操作均須在4狀態(tài)下進行5