質(zhì)粒提取方法詳解

1、第一節(jié)概述把一個(gè)有用的目的 DNA 片段通過重組DNA 技術(shù) ,送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體(Vector) 。細(xì)菌質(zhì)粒是重組 DNA 技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒 (Plasmid) 是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從 1-200kb 不等 ,為雙鏈、閉環(huán)的 DNA 分子 ,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中,它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力 ,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì),如離開宿主細(xì)胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,綞鑰股

2、氐目剮緣取質(zhì)粒 (又稱 F 因子或性質(zhì)粒 )、 R 質(zhì)粒 (抗藥性因子 )和 Col 質(zhì)粒 (產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質(zhì)粒。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:緊密控制型 (Stringentcontrol) 和松馳控制型(Relaxed control) 。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí) ,它也不能復(fù)制,通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有 1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子,如 F 因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制,在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝 ,一般在 20個(gè)以上 ,如 Col E1質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素時(shí) ,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體 DNA 復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制,

3、緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止,而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制,質(zhì)?？截悢?shù)可由原來 20 多個(gè)擴(kuò)增至 1000-3000 個(gè) ,此時(shí)質(zhì)粒 DNA 占總 DNA 的含量可由原來的2%增加至 40-50%.第二節(jié) 利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在,當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí) ,它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中彼此競(jìng)爭(zhēng),在一些細(xì)胞中 ,一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì) ,而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)幾代后,占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失,因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種,這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒通常含有編

4、碼某些酶的基因,其表型包括對(duì)抗生素的抗性,產(chǎn)生某些抗生素 ,降解復(fù)雜有機(jī)物 ,產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶等。第三節(jié)質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比,質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因 )和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測(cè)定的單鏈DNA 、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA 序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。一個(gè)理

5、想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（ 1）分子量小、多拷貝、松馳控制型； （ 2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)；（ 3）能插入較大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的檢測(cè)表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb 至 10kb 之間 ,如 PBR322、 PUC 系列、 PGEM 系列和 pBluescript （簡(jiǎn)稱 pBS ）等。從細(xì)菌中分離質(zhì)粒 DNA 的方法都包括3個(gè)基本步驟 :培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞;分離和純化質(zhì)粒 DNA 。采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS) 和 TritonX-100 可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS 或 TritonX-100

6、 處理后 ,細(xì)菌染色體DNA 會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上 ,同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多 ,易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí),細(xì)菌的線性染色體 DNA變性 ,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circularDNA, 簡(jiǎn)稱 cccDNA) 的兩條鏈不會(huì)相互分開,當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí),線狀染色體 DNA 片段難以復(fù)性 ,而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒 DNA 雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi) ,共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中,除了超螺旋DNA

7、外 ,還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA 。如果質(zhì)粒 DNA 兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán) DNA(OpencircularDNA, 簡(jiǎn)稱ocDNA) ；如果質(zhì)粒 DNA 的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀 DNA(LinearDNA) 。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA 電泳時(shí) ,同一質(zhì)粒 DNA 其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快。第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑一、材料含 pBS 的 E. coli DH5 或 JM 系列菌株 ,1.5ml 塑料離心管 (又稱 eppendorf 管 ), 離心管架。二、設(shè)備微量取液器 (20 l,200

8、 l,1000 臺(tái)l),式高速離心機(jī),恒溫振蕩搖床, 高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋 ), 渦旋振蕩器 , 電泳儀 ,瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。三、試劑LB液體培養(yǎng)基 (Luria-Bertani) ：稱取蛋白胨 (Tryptone)10g,酵母提取物 (Yeast extract) 5 g,NaCl10g,溶于 800ml 去離子水中 ,用 NaOH 調(diào) pH 至 7.5,加去離子水至總體積1升 ,高壓下蒸氣滅菌 20分鐘。LB 固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉 ,高壓滅菌。氨芐青霉素 (Ampicillin, Amp) 母液：配成50mg/ml水溶液 , -20 保存?zhèn)溆?。溶菌?/p>

9、溶液： 用 10mmol/L TrisCl(pH8·.0) 溶液配制成 10mg/ml, 并分裝成小份 (如 1.5ml) 保存于 -20 ,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。3mol/l NaAc(pH5.2) ： 50ml 水中溶解 40.81gNaAc·3H2O, 用冰醋酸調(diào) pH 至 5.2, 加水定容至 100ml,分裝后高壓滅菌,儲(chǔ)存于 4冰箱。溶液： 50 mmol/L葡萄糖 ,25 mmol/LTris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0) 。 溶液可成批配制 ,每瓶 100ml, 高壓滅菌 15 分鐘 ,儲(chǔ)存于 4冰箱。溶液： 0.2

10、mol/LNaOH (臨用前用 10mol/LNaOH 母液稀釋 ),1 SDS。溶液： 5mol/LKAc 60ml, 冰醋酸 11.5ml,H2O28.5ml, 定容至 100ml,并高壓滅菌。 溶液終濃度為 : K+ 3mol/L,Ac 5mol/L 。RNA 酶 A 母液：將 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris Cl(pH7·.5), 15mmol/LNaCl 中 ,配成 10mg/ml的溶液 ,于 100 加熱 15分鐘 ,使混有的 DNA酶失活。 冷卻后用 1.5ml eppendorf 管分裝成小份保存于-20 。飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物,這些產(chǎn)物可

11、引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA 和 DNA的交聯(lián),應(yīng)在 160用冷凝管進(jìn)行重蒸。重蒸酚加入0.1的 8- 羥基喹啉 (作為抗氧化劑),并用等體積的 0.5mol/L TrisCl· (pH8.0) 和 0.1mol/LTrisCl(pH8·.0) 緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并使其pH 值達(dá)到 7.6以上 ,因?yàn)樗嵝詶l件下DNA 會(huì)分配于有機(jī)相。氯仿 :按氯仿 :異戊醇 24:1 體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。按體積/體積 1:1 混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿 (1:1) 。酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性,操作

12、時(shí)應(yīng)戴手套。TE 緩沖液：10 mmo/L Tris Cl· (pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0) 。高壓滅菌后儲(chǔ)存于 4冰箱中。STET ：0.1 mol/LNaCl,10mmol/LTris Cl(pH8·.0),10mmol/L EDTA (pH8.0),5% Triton X-100 。STE： 0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris Cl(pH8·.0),1mmol/LEDTA(pH8.0) 。電泳所用試劑：（1） TBE緩沖液(5 ×)：稱取Tris 54g,硼酸 27.5g, 并加入0.5MEDTA(pH8.0

13、) 20ml, 定溶至 1000ml 。 （ 2）上樣緩沖液 (6 ×)： 0.25% 溴酚藍(lán) ,40% (w/v) 蔗糖水溶液。第三節(jié) 操作步驟一、細(xì)菌的培養(yǎng)和收集將含有質(zhì)粒pBS 的 DH5 菌種接種在LB 固體培養(yǎng)基 (含 50g/ml Amp) 中 , 37 培養(yǎng) 12-24 小時(shí)。用無菌牙簽挑取單菌落接種到 5ml LB 液體培養(yǎng)基 (含 50g/ml Amp) 中 ,37 振蕩培養(yǎng)約 12小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。二、質(zhì)粒 DNA 少量快速提取質(zhì)粒 DNA 小量提取法對(duì)于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒共同特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速,能同時(shí)處理大量試樣,所得 DNA 有一定純度析的需

14、要。DNA 十分有用。 這些方法,可滿足限制酶切割、電泳分（一）、煮沸法將 1.5ml 培養(yǎng)液倒入 eppendorf 管中 ,4下 12000 離心 30 秒。棄上清 ,將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘 ,使液體流盡。將菌體沉淀懸浮于 120ml STET 溶液中 , 渦旋混勻。加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),渦旋振蕩 3秒鐘。將 eppendorf 管放入沸水浴中,50秒后立即取出。用微量離心機(jī)4下 12000g 離心 10分鐘。用無菌牙簽從eppendorf 管中去除細(xì)菌碎片。取 20ml 進(jìn)行電泳檢查。注意 對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DN

15、A 。煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時(shí) ,細(xì)菌裂解效果反而不好。有時(shí)不同溶菌酶也能溶菌。提取的質(zhì)粒DNA 中會(huì)含有RNA, 但 RNA 并不干擾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應(yīng)等。（二）、 堿法取1.5ml 培養(yǎng)液倒入 1.5ml eppendorf 管中 ,4下 12000g 離心 30 秒。棄上清 ,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘 ,使液體流盡。菌體沉淀重懸浮于100 l溶液中 (需劇烈振蕩 ),室溫下放置5-10 分鐘。加入新配制的溶液200 l,蓋緊管口 ,快速溫和顛倒eppendorf 管數(shù)次 ,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩 ), 冰浴 5分鐘。加入 150 l預(yù)冷的溶

16、液,蓋緊管口 ,并倒置離心管,溫和振蕩 10秒 ,使沉淀混勻 ,冰浴中 5-10 分鐘 ,4下 12000g 離心 5-10分鐘。上清液移入干凈 eppendorf 管中 ,加入等體積的酚 /氯仿 (1:1), 振蕩混勻 ,4下 12000g 離心 5分鐘。將水相移入干凈 eppendorf 管中 ,加入 2倍體積的無水乙醇 ,振蕩混勻后置于 -20 冰箱中 20分鐘 ,然后4下 12000g 離心 10分鐘。棄上清 ,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入 1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下 12000g 離心 5-10分鐘。吸除上清液 ,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥 10分鐘

17、或室溫干燥。將沉淀溶于 20 l TE 緩沖液 (pH8.0, 含 20 g/ml RNaseA) 中 ,儲(chǔ)于 -20冰箱中。注意 提取過程應(yīng)盡量保持低溫。提取質(zhì)粒DNA 過程中除去蛋白很重要,采用酚 /氯仿去除蛋白效果較單獨(dú)用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。沉淀 DNA 通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時(shí)間稍長(zhǎng)可使DNA 沉淀完全。 沉淀 DNA 也可用異丙醇 (一般使用等體積),且沉淀完全,速度快 ,但常把鹽沉淀下來,所以多數(shù)還是用乙醇。（三）、 Wizard 少量DNA純化系統(tǒng)Promega 公司的Wizard 少量 DNA 純化系統(tǒng)可快速有效的抽提質(zhì)粒DNA, 整個(gè)過程只需1

18、5分鐘。提取的質(zhì)?？芍苯佑糜贒NA測(cè)序、酶切分析和體外轉(zhuǎn)錄等。該系統(tǒng)中所含試劑和柱子可以用于50次 1-3ml 質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化,試劑包括 10ml 細(xì)胞懸浮液,10ml 細(xì)胞裂解液； 10ml 中和液 ,50mlWizard 少量 DNA 純化樹脂 ,50ml 柱洗液（使用前加95%乙醇至 120ml)和 50支 Wizard 微型柱。1-3ml 過夜培養(yǎng)細(xì)胞液4下12000g 離心 1-2 分鐘。去除上清液 ,菌體細(xì)胞懸浮于200 l細(xì)胞懸浮液中,充分混合 ,并移入 eppendorf 管中。加 200 l 細(xì)胞裂解液 , 顛倒離心管數(shù)次 ,直到溶液變清亮。加 200 l 中和液 ,

19、顛倒離心管數(shù)次。4下 12000g 離心 5分鐘 ,取上清液于新的eppendorf 管中。加 1ml Wizard 少量DNA純化樹脂 ,顛倒離心管數(shù)次以充分混勻。取一次性注射器, 取出注塞 ,并使注射筒與Wizard 微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中 ,并用注塞輕推,使混合物進(jìn)入微型柱。將注射器與微型柱分開,取出注塞 , 再將注射筒與微型柱相連,加入 2ml 柱洗液 ,并用注塞輕推柱洗液進(jìn)入微型柱。,使取出微型柱置于eppendorf 管中 ,離心 2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。將微型柱放在一個(gè)新eppendorf 管中 ,加 50 l TE( 或水 )于微型柱中 ,靜止 1分

20、鐘后心20 秒。,4下 12000g離丟棄微型柱,將 eppendorf管中的質(zhì)粒DNA貯于 4或 -20冰箱。注意 樹脂使用前應(yīng)充分混勻,如有結(jié)晶,可將樹脂用25-37水浴處理10分鐘。三、質(zhì)粒DNA 的大量提取和純化在制作酶譜、測(cè)定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA, 為此需要大量提取質(zhì)粒 DNA 。大量提取的質(zhì)粒DNA 一般需進(jìn)一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。（一）、堿法取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的含pBS 質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液250ml,4 下 5000g 離心 15分鐘 ,棄上清管倒置使上清液全部流盡。將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50ml 用冰預(yù)冷的STE 中（此步可省略）

21、 。,將離心同步驟 1方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于加入 12ml 新配制的溶液加 9ml 用冰預(yù)冷的溶液5ml 溶液 I 中 ,充分懸浮菌體細(xì)胞。II,蓋緊瓶蓋 ,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴 10分鐘。III,搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置 15分鐘 ,此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。4下 5000g離心 15分鐘。取上清液 ,加入 50ml RNA 酶 A(10mg/ml),37 水浴 20分鐘。加入等體積的飽和酚/氯仿 ,振蕩混勻 ,4下 12000g 離心 10分鐘。取上層水相 , 加入等體積氯仿,振蕩混勻 ,4下 12000g 離心 10分鐘。取上層水

22、相 ,加入 1/5 體積的 4mol/LNaCl 和 10% PEG(分子量 6000), 冰上放置 60分鐘。4下 12000g 離心 15分鐘 , 沉淀用數(shù)ml 70% 冰冷乙醇洗滌,4下 12000g 離心 5分鐘。真空抽干沉淀,溶于 500mlTE 或水中。注意 提取過程中應(yīng)盡量保持低溫。加入溶液II 和溶液III 后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。由于 RNA 酶 A 中常存在有DNA 酶 ,利用 RNA 酶耐熱的特性,使用時(shí)應(yīng)先對(duì)該酶液進(jìn)行熱處理(801小時(shí) ), 使DNA酶失活。（二）、 Wazard 大量DNA純化系統(tǒng)堿法大量提取DNA 往往需要很長(zhǎng)的時(shí)間.Promega 公司的 W

23、iazrd 大量 DNA 純化系統(tǒng)既簡(jiǎn)單又快速 ,只需要離心和真空抽干,這個(gè)系統(tǒng)可以從500ml 培養(yǎng)液中在 3小時(shí)以內(nèi)獲得1mg 以上的高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(200-20000bp) 。該系統(tǒng)不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA 溶于水或TE 緩沖液中,不含任何鹽份,可以直接用于DNA 序列分析和酶切反應(yīng),也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等。該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可以用于10次 100-500ml 質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化,試劑包括 : 150ml 細(xì)胞懸浮液,150ml細(xì)胞裂解液,150ml 中和液 ,100mlWizard大量 DNA 純化樹脂 ,125

24、mlWizard 柱子洗脫溶液和10支 Wizard 帶有存儲(chǔ)離心管的柱子。100-500ml細(xì)胞培養(yǎng)液置離心管中, 22-25 下 5000g 離心 10分鐘 ,所得細(xì)胞沉淀充分懸浮于細(xì)胞懸浮液中。加 15ml 細(xì)胞裂解溶液并輕輕混合,可以反復(fù)倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細(xì)胞裂解完全時(shí),溶液會(huì)變清 ,這一步需要 20分鐘。加 15ml中和溶液,立即反復(fù)倒置離心管數(shù)次,并使之混勻。14000g,22-25 離心15分鐘。小心地將上清液吸出并移至一個(gè)新離心管中。加 0.5倍體積的異丙醇 ,混合均勻 , 14000g 22-25 下離心 15分鐘。棄上清 ,懸浮 DNA 沉淀于 2ml TE 緩沖

25、液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。加 10ml Wizard 大量 DNA 純化樹脂溶液 , 并渦旋混合。每一個(gè)樣品 ,使用一支大量柱子 Wizard,柱子的頭插在真空器上(Promega產(chǎn)品 ,與此配套)。將樹脂 /DNA將樹脂 /DNA混合液轉(zhuǎn)入柱子中,真空抽取樹脂/DNA 混合液?；旌弦撼楦珊?加 13ml 柱子洗脫溶液至離心管中, 對(duì)管底部的樹脂/DNA進(jìn)行洗脫(柱子一邊旋轉(zhuǎn)一邊加入洗脫液),并加入柱子中。真空抽干所加入的洗脫。再加 12ml 柱子洗脫液進(jìn)柱子并抽干。加入 5ml 80乙醇漂洗柱中的樹脂, 柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(1300g) 離心 5分鐘。取出柱子 ,真空抽干 5分鐘 ,再將柱子放入系統(tǒng)中