天然和人工培育冬蟲(chóng)夏草的比較蛋白質(zhì)學(xué)表征及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)估

1、題目：A comparative proteomic characterization and nutritional assessment of naturally-and artificially-cultivated Cordyceps sinensis期刊：Journal of Proteomics影響因子：2合作技術(shù)：Label-free研究背景冬蟲(chóng)夏草因其營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值而受到越來(lái)越多的關(guān)注。近期，有報(bào)道稱，成功通過(guò)人工方式培育出冬蟲(chóng)夏草。本文主要使用非標(biāo)定量Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究自然生長(zhǎng)和人工培育的冬蟲(chóng)夏草之間的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，揭示冬蟲(chóng)夏草蛋白質(zhì)組學(xué)特征，了解其發(fā)育

2、感染過(guò)程，并為人工培育提供參考信息。研究思路1. 實(shí)驗(yàn)材料：天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草，各分為蟲(chóng)體和子座，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，共計(jì)12個(gè)樣本。2. 實(shí)驗(yàn)方法：Label-free，LC-MS3. 研究策略：蛋白組、代謝組研究?jī)?nèi)容和結(jié)果1. 蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果及蛋白質(zhì)控人工培育的蟲(chóng)草和青藏高原上自然生長(zhǎng)的蟲(chóng)草在形態(tài)特征高度相似（圖1），并各自選擇3個(gè)批次的樣本進(jìn)行蛋白提取。將蟲(chóng)草分為蟲(chóng)體和子座，分別用SDS-PAGE對(duì)樣本蛋白進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)（圖2）。對(duì)解析的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，肽段質(zhì)量Da，說(shuō)明質(zhì)譜鑒定肽段準(zhǔn)確度高，肽段長(zhǎng)度范圍為8-38個(gè)氨基酸，分子量范圍為400-12000Da，與預(yù)設(shè)分子量范

3、圍一致。在本次實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)鑒定蛋白含有2-20個(gè)unique肽段。圖1天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草形態(tài)比對(duì)圖2樣品蛋白SDS-PAGE質(zhì)控結(jié)果使用變異系數(shù)（CV）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性，在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，人工培育的蟲(chóng)體（AC）、子座（AS）、天然生長(zhǎng)的蟲(chóng)體（NC）、子座（NS）的CV值中位數(shù)分別為%，%。12個(gè)樣品的相關(guān)性系數(shù)在之間，這些結(jié)果證明了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。在所有的鑒定蛋白中，基于強(qiáng)度的絕對(duì)定量（iBAQ）值分布在1200中最豐富的蛋白質(zhì)中（圖3A）。所有樣品和組內(nèi)蛋白質(zhì)的平均iBAQ值相似（圖3B）。這些結(jié)果表明蛋白質(zhì)組內(nèi)比較可能不受蛋白質(zhì)豐度系統(tǒng)差異的影響。圖3鑒定蛋白的絕對(duì)定量值（iBA

4、Q）分布2. 天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草的蛋白表達(dá)圖譜在本次實(shí)驗(yàn)中，12個(gè)樣品共鑒定到22829條可信肽段（conf 95%），2541個(gè)蛋白質(zhì)。使用PCA分析天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草蛋白表達(dá)圖譜特征，發(fā)現(xiàn)雖然蟲(chóng)體和子座蛋白質(zhì)分布有明顯區(qū)別，但是天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草的整體蛋白質(zhì)分布類似（圖4）。COG功能注釋到了1951個(gè)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)主要參與能量產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)（圖5）。圖4PCA分析結(jié)果圖5COG功能注釋結(jié)果3. 顯著差異蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果本次實(shí)驗(yàn)中，顯著差異蛋白數(shù)目分別為107（NC/AC）、58（NS/AS），195（AC/AS）、168（NC/NS）。使用層次聚類分

5、析蛋白質(zhì)表達(dá)變化趨勢(shì)，主要聚成三類，Cluster I 由在AS中增加并在NC中減少的蛋白質(zhì)組成；Cluster II包括在AC中降低并在NS中增加的蛋白質(zhì)；Cluster III包括在AC或NC中增加并在AS和NS中均降低的蛋白質(zhì)（圖6）。為了確定這些蛋白質(zhì)的功能特性，將它們的序列映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)。GO富集表明這些差異豐富的蛋白質(zhì)主要參與生物調(diào)節(jié)、單一生物過(guò)程，結(jié)合、催化活性，并定位于細(xì)胞器、細(xì)胞膜。結(jié)果說(shuō)明這些顯著差異蛋白在蟲(chóng)草生命活動(dòng)中主要發(fā)揮催化和結(jié)合作用（圖7）。圖6層次聚類分析結(jié)果圖7差異蛋白GO富集結(jié)果4. 顯著差異蛋白Pathway Enrichment 結(jié)果為了進(jìn)一步研探索發(fā)

6、生變化的生物學(xué)途徑，使用KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析，結(jié)果表明，天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草之間的差異蛋白主要參與次生代謝物合成、丙酮酸代謝、賴氨酸生物合成。在氨基酸合成、代謝途徑中（圖8），有7種相關(guān)蛋白發(fā)生表達(dá)量變化，其中，核糖5-磷酸異構(gòu)酶（K01807）和丙酮酸激酶（K00873）在NC中降低，而NADH（P）結(jié)合蛋白（K00831）在NC中增加； NS中糖基轉(zhuǎn)移酶（K00766）和雄性不育蛋白（K00143）增加；異檸檬酸/異丙基蘋果酸脫氫酶（K00052）在NC中降低但在NS中升高，精氨酸琥珀酸合成酶（K01940）在NC和NS中均下降。圖8氨基酸合成/代謝途徑為了驗(yàn)證組

7、學(xué)結(jié)果，LC-MS分析蟲(chóng)草代謝產(chǎn)物。根據(jù)代謝組學(xué)結(jié)果，共鑒定出8種氨基酸，其中4種氨基酸含量發(fā)生顯著改變，具體為賴氨酸，精氨酸，蘇氨酸和絲氨酸（圖9）。氨基酸的變化趨勢(shì)跟上游合成它們的酶的變化趨勢(shì)是一直的。根據(jù)中國(guó)藥典中關(guān)于測(cè)定核苷和核苷酸含量，特別是腺苷的規(guī)定，NC/NS以及AC/AS總離子色譜圖中沒(méi)有觀察到顯著差異（圖10）。圖9代謝組鑒定結(jié)果圖10核苷酸含量測(cè)定蟲(chóng)草蛋白質(zhì)中必須氨基酸比例與人類蛋白質(zhì)中的比例相似，說(shuō)明它具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。而且，天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草蛋白質(zhì)中氨基酸成分和含量幾乎相同，沒(méi)有顯著差異。文章小結(jié)該研究提供了天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草的蛋白表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)

8、草的真菌中的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物組成相似，而蟲(chóng)體和子座的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物方面則有區(qū)別。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明氨基酸合成和代謝途徑受到栽培方式的影響。 這些蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)將有助于理解冬蟲(chóng)夏草的藥用價(jià)值，并為其人工培育提供參考。解析文獻(xiàn)Xu Zhang, Qun Liu, Wei Zhou,et al. A comparative proteomic characterization and nutritional assessment of naturally-and artificially-cultivated Cordyceps sinensis. Journal of Proteomics, 2

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