通心絡(luò)膠囊對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響及其作用機(jī)制初步研究

1、通心絡(luò)膠囊對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響及其作用機(jī)制初步研究李振彬 杜志峰 楊志霞白求恩國(guó)際和平醫(yī)院風(fēng)濕免疫科/中西醫(yī)結(jié)合研究室(石家莊，050082)【摘要】目的探討通心絡(luò)膠囊對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的治療作用及其相關(guān)機(jī)制。方法采用Wistar大鼠復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，分為模型組、通心絡(luò)大劑量1.0g/(kg·d)組、通心絡(luò)小劑量0.5g/(kg·d)組、雷公藤多苷片8mg/（kg·d）組和正常對(duì)照組，給藥2周后測(cè)定各組大鼠足爪容積，采血檢測(cè)SOD、MDA、NO和IL-1、TNF-。結(jié)果不同劑量通心絡(luò)對(duì)大鼠AA模型的關(guān)節(jié)腫脹率均有明顯抑制作用(P0.05)，其抑制率與雷

2、公藤多苷片相當(dāng)。通心絡(luò)各劑量組均可升高AA大鼠血清SOD、IL-1、TNF-水平，降低MDA和NO含量。除通心絡(luò)小劑量組對(duì)TNF-的抑制作用較雷公藤多苷片更強(qiáng)外，其余各因子的水平與雷公藤多苷片無顯著差異。結(jié)論通心絡(luò)對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有顯著抑制作用，其作用機(jī)制可能與抑制前炎癥細(xì)胞因子生成、抗氧化等有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】通心絡(luò)；佐劑性關(guān)節(jié)炎；白細(xì)胞介素-1；腫瘤壞死因子-；抗氧化The effect and action mechanism of Tongxinluo capsule on adjuvant arthritis in ratsLi Zhenbin， Du Zhifeng， Yang Z

3、hixia. Department of Rheumatosis and Immunity， Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang 050082，China【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutic effect and action mechanism of Tongxinluo capsule on adjuvanT-induced arthritis(AA) in rats.MethodsThe adjuvant arthritis model was made in W

4、istar rats. The rats were divided in 5 groups，model group，high dose Tongxinluo group 1.0g/(kg·d)，low does Tongxinluo group 0.5g/(kg·d)，tripterygium wilfordii multiglycoside 8mg/(kg·d) group and blank control group.The toes volume of rats in each group was measured，and the serum super

5、oxide dismutase (SOD)，MDA， nitric oxide (NO)， interleukiN-1 (IL-1) and tumor necrosis factor- (TNF-) were detected after 2.weeksadministration.ResultsThe Tongxinluo AT-different doses had obvious inhibition effect on swelling rate of adjuvant arthritis rAT-(P0.05)，which was similar to thAT-of tripte

6、rygium wilfordii multiglycoside. Tongxinluo AT-different doses could increase the levels of SOD，IL-1，TNF- in AA rats， and decrease the levels of MDA and NO.ConclusionTongxinluo capsule has obvious inhibition effect on AA， and the action mechanism may be related with the antioxidation and inhibition

7、of the production of pro inflammatory cytokines.【Key words】Tongxinluo; adjuvant arthritis; interleukiN-1 ; tumor necrosis factor-; antioxidation類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫病，迄今原因未明，尚無理想的治療藥物。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA屬于“痹證”范疇，系由于素體虛弱，外受風(fēng)、寒、濕諸邪，阻滯經(jīng)絡(luò)所致。通心絡(luò)膠囊由人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、冰片等組成，具有益氣活

8、血、通絡(luò)止痛等功效，是目前用于心腦血管病治療的新型中藥制劑。本文擬探討通心絡(luò)對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的治療作用，并對(duì)其療效機(jī)制進(jìn)行初步探討。1材料與方法1.1材料Wistar大鼠(雄性，體重150180g，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；通心絡(luò)干粉(石家莊以嶺藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，采用生理鹽水溶解并稀釋為溶液)；雷公藤多苷片(湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司提供)；注射用卡介苗(衛(wèi)生部北京生物制品研究所提供)；檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；722型光柵分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；放免計(jì)數(shù)儀(西安二六二廠)；DL5000B型冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；容積測(cè)量?jī)x(自制)。1.2大鼠AA模型的

9、建立與分組將12的羊毛脂與液體石蠟混合共熱至80充分混勻，高壓消毒，然后將其與充分研磨的卡介苗按1(ml)7.5(mg)的比例配成完全弗氏佐劑。于Wistar大鼠右后足跖底部常規(guī)皮膚消毒后，用微量注射器皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑0.1ml/只；另取8只Wistar大鼠作為正常對(duì)照組，用同樣方法于其右足皮內(nèi)注射等量生理鹽水。造模后第19天，將出現(xiàn)二次反應(yīng)的大鼠隨機(jī)分成模型組、通心絡(luò)大劑量組、通心絡(luò)小劑量組、雷公藤多苷片組，每組8只。測(cè)定各組大鼠雙側(cè)后足爪容積后，治療各組灌胃給藥，通心絡(luò)高劑量組為1.0g/（kg·d）、通心絡(luò)小劑量組0.5g/（kg·d）、雷公藤多甙片組為8mg/（

10、kg·d），模型組及正常對(duì)照組分別給予等量生理鹽水。于給藥后第15天測(cè)量各組大鼠足爪容積并計(jì)算腫脹率。1.3SOD、MDA和NO檢測(cè)給藥結(jié)束后第2天，經(jīng)大鼠眼眶采血，4離心(3500r/min，10min)，分離血清，-80保存?zhèn)錂z。采用羥胺法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用TBA法檢測(cè)脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量；采用硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮（NO)含量。試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均分別3%和7%。嚴(yán)格按檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用722型光柵分光光度計(jì)分別進(jìn)行SOD、MDA和NO定量檢測(cè)。1.4IL-1、TNF-測(cè)定血清采集、保

11、存方法同上。腫瘤壞死因子-(TNF-)和白細(xì)胞介素-1(IL-1)水平測(cè)定均采用放射免疫分析(RIA)法。TNF- RIA Kit、 IL-1 RIA Kit均由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均分別5%和10%。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用放免計(jì)數(shù)儀測(cè)定IL-1和TNF-含量。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異采用單因素方差分析(AVOVA)。以P0.05為差異有顯著意義。2結(jié)果2.1通心絡(luò)對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量通心絡(luò)對(duì)Wistar大鼠AA模型的關(guān)節(jié)腫

12、脹率均有明顯抑制作用，其抑制率與雷公藤多苷片相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹率的影響未顯示量效關(guān)系，大劑量組的抑制作用與小劑量組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。見表1。表1通心絡(luò)對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹率的影響(±s）組別劑量(mg/kg)動(dòng)物數(shù)(n)關(guān)節(jié)腫脹率(%)抑制率(%)模型組-883.3±21.5-通心絡(luò)小劑量組500834.4±12.858.6 通心絡(luò)大劑量組1000836.4±10.156.3 雷公藤多苷片組8835.9±10.856.8 正常對(duì)照組-828.0±7.7-注：與模型組相比， P0.05。2.2通心

13、絡(luò)對(duì)AA大鼠血清SOD、MDA和NO含量的影響與正常對(duì)照組比較，Wistar大鼠造模后，血清SOD含量明顯降低，而MDA、NO含量顯著升高；與模型組比較，通心絡(luò)各劑量組及雷公藤多苷片組均可提高AA大鼠血清SOD水平，減少M(fèi)DA和NO含量，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。表2通心絡(luò)對(duì)AA大鼠血清SOD、MDA和NO含量的影響(±s，mmol/L)組別劑量(mg/kg)動(dòng)物數(shù)(n)SODMDANO模型組-819.2±10.68.8±1.641.8±9.6通心絡(luò)小劑量組500832.3±9.4 4.9±1.0 25.8±9 8 通心

14、絡(luò)大劑量組1000836.8±13.0 5.8±1.3 29.0±16 3 雷公藤多苷組8833.4±9.8 5.2±1.8 26.0±10.9 正常對(duì)照組-837.3±9.1 5.5±0.7 14.9±6.8 注：與模型組相比， P0.05， P0.01。2.3通心絡(luò)對(duì)AA大鼠血清IL-1、TNF-水平的影響Wistar大鼠造模后，與正常對(duì)照組比較，血清炎性細(xì)胞因子IL-1、TNF-水平明顯升高；與模型組比較各治療組給藥后均可顯著降低AA大鼠血清IL-1和TNF-水平。在抑制血清IL-1方面，組間(通心

15、絡(luò)大、小劑量及雷公藤多苷片組)比較未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而在抑制TNF-水平方面，通心絡(luò)小劑量組顯示出比雷公藤多苷片更強(qiáng)的作用。見表3。表3通心絡(luò)對(duì)AA大鼠血清IL-1和TNF-水平的影響(±s)組別劑量(mg/kg)動(dòng)物數(shù)(n)IL-1(ng/l)TNF-(ng/ml)模型組-80.115±0.0458.71±2.25通心絡(luò)小劑量組50080.065±0.023*5.17±1.90*通心絡(luò)大劑量組100080.056±0.022*6.42±1.15*雷公藤多甙片組880.050±0.019*7.03±1.1

16、0*正常對(duì)照組-80.075±0.042 5.64±1.16 注：與模型組相比，*P0.05；與雷公藤多甙片組相比，P0.05。3討論類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是臨床最常見的炎性關(guān)節(jié)病和主要致殘因素之一1，目前尚無特效療法。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1具有多重生物學(xué)功能，是免疫反應(yīng)、炎癥及組織損傷的主要介質(zhì)之一，在RA發(fā)病機(jī)制中占主要地位。IL-1通過活化滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、炎癥介導(dǎo)因子等多種生物效應(yīng)分子，同時(shí)引導(dǎo)炎癥細(xì)胞進(jìn)入炎癥發(fā)生部位2。IL-1還通過促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖，刺激滑膜細(xì)胞及破骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶和膠原酶，造成骨及關(guān)節(jié)損傷3。晚近研究表明4，T

17、NF-是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎持續(xù)發(fā)展和組織損傷病理過程中居中心地位的促炎癥細(xì)胞因子；TNF-誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子(ICAM-1)，促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附、滲透，引起局部炎癥；TNF-活化滑膜細(xì)胞及軟骨細(xì)胞產(chǎn)生PGE 2和膠原酶，從而導(dǎo)致骨質(zhì)破壞和骨吸收。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)可明顯抑制Wistar大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腫脹率，并下調(diào)AA大鼠血清IL-1和TNF-水平，提示抑制前炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生可能是通心絡(luò)治療實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)5，AA大鼠血漿MDA含量明顯增高，而紅細(xì)胞SOD活性顯著降低。RA患者關(guān)節(jié)內(nèi)氧化應(yīng)激是多種刺激的結(jié)果，包括滑膜腔壓力增加、毛細(xì)血管密度降低、滑膜組織的

18、代謝率增加和局部炎細(xì)胞激活等；RA中反應(yīng)氧合成增加的證據(jù)包括液體過氧化物合成水平增加，透明質(zhì)酸降解增加，血清和滑膜液壞血酸水平降低等6。在RA滑膜組織中還上調(diào)了NO合成，由細(xì)胞因子或細(xì)菌產(chǎn)物刺激誘導(dǎo)一氧化氮合酶來增加合成NO6。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，AA大鼠MDA和NO水平升高，而SOD活性下降；通心絡(luò)則可降低AA大鼠過高的MDA和NO水平，同時(shí)還使過低的SOD活性增高或恢復(fù)正常。由此推測(cè)，通心絡(luò)的抗關(guān)節(jié)炎作用與其降低脂質(zhì)過氧化、恢復(fù)抗氧化酶活性有關(guān)。通心絡(luò)膠囊是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制而成的中藥復(fù)方制劑。本研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠AA具有顯著的治療作用，其療效機(jī)制與抑制前炎癥細(xì)胞因子生成、抗氧化等有關(guān)；初步從藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)角度證實(shí)RA“