第七章體內(nèi)藥物濃度法(已修改)

1、 第二章第二章 體內(nèi)藥物濃度法體內(nèi)藥物濃度法第一節(jié)第一節(jié) 體內(nèi)藥物濃度測定樣本與實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)藥物濃度測定樣本與實(shí)驗(yàn)動物 種屬的選擇種屬的選擇第二節(jié)第二節(jié) 建立中藥體內(nèi)藥物濃度測定方法的建立中藥體內(nèi)藥物濃度測定方法的 技術(shù)要求技術(shù)要求第三節(jié)第三節(jié) 常用的中藥體內(nèi)藥物濃度測定方法常用的中藥體內(nèi)藥物濃度測定方法 第一節(jié)第一節(jié) 測定樣本與實(shí)驗(yàn)動物種測定樣本與實(shí)驗(yàn)動物種屬的選擇屬的選擇 對于有效成分明確且有效成熟的定量分析方法測定的中藥，可采用此法。 一、測定樣本一、測定樣本 常用的測定樣本有： 血液血液（血漿、血清、全血）、 尿液尿液、 唾液唾液、 淚液淚液（眼用制劑）、 乳汁乳汁（乳汁排除藥物對乳兒

2、的影響）、 臟器勻漿等臟器勻漿等. . 二、實(shí)驗(yàn)動物的選擇二、實(shí)驗(yàn)動物的選擇1、盡可能與藥理學(xué)、毒理學(xué)研究一致，以便聯(lián)系藥效學(xué)進(jìn)行分析討論。2、最好從同一只動物多次采樣，采樣時間采樣時間為自變自變量量，必須準(zhǔn)確，操作迅速。3、小鼠、大鼠、兔（口服不用）、犬較為常用。 第二節(jié)第二節(jié) 測定方法的技術(shù)要求測定方法的技術(shù)要求一、一、靈敏度高 血藥濃度常在ng/mlng/ml級 。二、二、專一性強(qiáng) 能排除排除藥物代謝產(chǎn)物及機(jī)體 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾干擾。三、三、準(zhǔn)確度高，精密度高四、四、快速、簡便 第三節(jié)第三節(jié) 常用的中藥體內(nèi)藥物常用的中藥體內(nèi)藥物濃度測定方法濃度測定方法 一、分光光度法一、分光光度法 （一

3、）（一） 紫外分光光度法紫外分光光度法 （二）（二） 熒光分光光度法熒光分光光度法 （三）（三） 原子吸收光譜法原子吸收光譜法 二、色二、色 譜譜 法法 （一）薄層層析（一）薄層層析（TLCTLC）法）法 （二）高效液相（二）高效液相（HPLCHPLC）法）法 （三）氣相色譜（三）氣相色譜（GCGC）法）法高效液相色譜法高效液相色譜法 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLCHPLC） 是在經(jīng)典液相色譜和氣象色譜的理論與技術(shù)上發(fā)展起來的一種現(xiàn)代化色譜分析方法。該法由于采用高效固定相、高壓輸液泵、高靈敏檢測器等新技術(shù)，從而成為色譜法中應(yīng)用最為廣泛的一種分析方法。具有樣品適用范圍廣，預(yù)處理簡單，快

4、速，靈敏，專一等優(yōu)點(diǎn)。 1. HPLC法的選擇法的選擇 高效液相色譜法的種類較多，包括液-固吸附色譜法、液-液分配色譜法（正相或反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法、凝膠色譜法。選擇色譜方法必須考慮所分離化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和溶解度。關(guān)于選擇各類高效液相色譜法的原則見下圖。 樣品分子量 10000凝膠色譜2. 檢測器的分類及選擇檢測器的分類及選擇 紫外檢測器紫外檢測器（UVDUVD）：主要有以下幾種類型：固定波長型固定波長型：用得較多的是波長為254nm的紫外光。因大多數(shù)芳香族、芳雜環(huán)、稠芳環(huán)等在此處均有吸收?？烧{(diào)波長型可調(diào)波長型：相當(dāng)于一臺紫外可見分光光度計(jì)。由于波長可任意調(diào)整，可以選擇試樣的最

5、大吸收波長進(jìn)行檢測，提高靈敏度。掃描型掃描型：不僅可選擇波長，還有快速掃描裝置，記錄組分的吸收光譜，使定性分析更方便。光電二極管陣列型光電二極管陣列型：一次操作可獲得包括波長、吸收值和時間在內(nèi)的三維譜圖，還可得到難分離組分重疊峰的有關(guān)信息。 熒光檢測器（熒光檢測器（FLDFLD）：）：相當(dāng)于一臺熒光光度計(jì)?；谀承晒馕镔|(zhì)吸收一定波長紫外光后發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。 蒸發(fā)光散射檢測器（蒸發(fā)光散射檢測器（ELSDELSD）：）：其基本原理是樣品氣化后，溶質(zhì)粒子的散射光強(qiáng)度與其濃度成正比。 此外還有視差折光檢測器視差折光檢測器、電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器等等。 3. 3. 樣品預(yù)

6、處理技術(shù)（1 1）試樣的預(yù)處理：）試樣的預(yù)處理：生物樣品中含有蛋白質(zhì)和其它干擾物質(zhì)，處理不好直接影響柱子的壽命和柱效。另外體液中藥物及代謝產(chǎn)物含量很低，還需盡可能加以濃縮。除去蛋白質(zhì)等其它干擾物質(zhì)，加入沉淀劑改變蛋白質(zhì)等電點(diǎn)溶劑提取法 酸性物質(zhì)酸化 然后用與水不相溶的溶劑 堿性物質(zhì)堿化 提取 表（7-16）列出了一般藥品的提取方法。表7-16 一般藥品提取方法樣品性質(zhì) 提取方法 水溶性樣品 1.酸性藥物及其鹽 有機(jī)溶劑提取雜質(zhì)后調(diào)成酸性,再加入有 機(jī)溶劑提取,或在N2流吹下,用適當(dāng)溶劑溶 解后進(jìn)樣。 2.堿性藥物及其鹽 有機(jī)溶劑提取雜質(zhì)后調(diào)成堿性，再加入有 機(jī)溶劑提取，可直接進(jìn)樣，或在N2流下

7、吹干， 用適當(dāng)溶劑溶解后進(jìn)樣。 3. 中性藥物 有機(jī)溶劑提取后，直接用反相色譜法分析。 脂溶性樣品 有機(jī)溶劑提取后，或進(jìn)樣，或在N2流下吹 干，用適當(dāng)溶劑溶解后進(jìn)樣。 薄層色譜或預(yù)柱色譜分離 活性碳 氧化鋁 填充劑 離子交換樹脂等膜過濾法：以一定大小孔徑的微孔膜，除去一定分子量以上的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、細(xì)胞等。 （2 2）衍生物制備：）衍生物制備：對于無紫外和熒光吸收的藥物可采用化學(xué)衍生法。將樣品經(jīng)過簡單的處理，引入對紫外或熒光吸收性強(qiáng)的發(fā)色團(tuán)，使其生成在紫外區(qū)有強(qiáng)吸收或能發(fā)射熒光的衍生物，提高檢測靈敏度和選擇性。包括柱前和柱后衍生 。 柱前衍生：柱前衍生：將樣品制備成衍生物后再進(jìn)樣，此法不改變儀器

8、結(jié)構(gòu)，但分離度較差； 柱后衍生：柱后衍生：色譜柱流出液與反應(yīng)液柱后混合，反應(yīng)后再進(jìn)入檢測器。此法需改變儀器結(jié)構(gòu)，但分離度高。 例如：例如：十二烷基硫磺酸鈉作膠束試劑使延胡索乙素的熒光強(qiáng)度增大5.5倍。a. -CD包合物增敏熒光法可降低秦皮甲、乙素的最低檢出濃度，進(jìn)行微量痕量檢測。 4. 4. 常見定量法常見定量法（1 1）歸一化法：）歸一化法： 將樣品中所有出峰組分含量之和作為100%，求出其中某一組分含量百分?jǐn)?shù)的方法。計(jì)算公式為：%1002211111nnfAfAfAfAC 其中 C Ci i% %：i組分的重量百分含量 f fi i： i組分的校正因子（由于檢測器對各組分的靈敏度不同，同樣

9、濃度在色譜圖上呈現(xiàn)的面積并不相同，因此應(yīng)校正。fi可通過有關(guān)手冊查到 。） 歸一化法 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：方法簡便，結(jié)果比較準(zhǔn)確，定量結(jié)果與進(jìn)樣量無關(guān)，操作條件變化對結(jié)果影響較小。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：所有組分都必須在在操作時間內(nèi)流出色譜柱，且檢測器對它們都產(chǎn)生信號。 （2 2）內(nèi)標(biāo)法：）內(nèi)標(biāo)法： 是指向樣品溶液中準(zhǔn)確加入一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行液相分析，根據(jù)樣品和內(nèi)標(biāo)物的重量及其相應(yīng)的峰面積之比，求出待測組分含量。 測定方法：測定方法：準(zhǔn)確稱量樣品M克，取一純物質(zhì)（內(nèi)標(biāo)物）適量Ms，加入樣品中，混勻，進(jìn)樣。根據(jù)待測組分i的峰面積（Ai）及內(nèi)標(biāo)物的峰面積（As），依據(jù)下列關(guān)系可求出樣品中i組分的百分含量Ci%。

10、 因?yàn)樗?100%MMfAfACsssiiissiisifAfAMM%100%MMCii 對內(nèi)標(biāo)物的要求：對內(nèi)標(biāo)物的要求： 內(nèi)標(biāo)物在結(jié)構(gòu)上或官能團(tuán)類型上與被測組分相似，但應(yīng)為原樣品中所不含有的組分，否則會使峰重疊而無法準(zhǔn)確測量內(nèi)標(biāo)物的峰面積。 內(nèi)標(biāo)物的保留時間應(yīng)與待測組分相近，但能完全分開。 內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。 內(nèi)標(biāo)法具備歸一化法的優(yōu)點(diǎn)，只要被測組分與內(nèi)標(biāo)物產(chǎn)生信號即可定量，結(jié)果比較準(zhǔn)確，不需準(zhǔn)確進(jìn)樣，很適合于中草藥及其復(fù)方某些有效成分的血藥濃度測定。 缺點(diǎn)：每次分析都要準(zhǔn)確稱量樣品和內(nèi)標(biāo)物的重量，而且理想的內(nèi)標(biāo)物不易尋找。（3 3）外標(biāo)法：）外標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)物不易選定時，可用外

11、標(biāo)法。外標(biāo)法又分工作曲線法分工作曲線法與外標(biāo)一點(diǎn)法外標(biāo)一點(diǎn)法等。 工作曲線法：工作曲線法：配制欲定量組分對照品一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確進(jìn)樣，測量其峰高或峰面積。以峰高或峰面積對標(biāo)準(zhǔn)液的濃度繪制工作曲線。然后再按相同操作條件進(jìn)行樣品測定，測出待測組分的峰高或峰面積，利用工作曲線定量。 外標(biāo)一點(diǎn)法：外標(biāo)一點(diǎn)法：工作曲線法計(jì)算含量時會出現(xiàn)兩種情況：標(biāo)準(zhǔn)曲線過原點(diǎn)，截距為零；標(biāo)準(zhǔn)曲線不過原點(diǎn)，截距不為零，說明系統(tǒng)存在誤差。當(dāng)截距為零時，可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量。 C C A A 定義：定義：用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同量進(jìn)樣多次，算出峰面積平均值，然后取樣品溶液在相同條件下操作，所測得的峰面積按下式計(jì)算含量：

12、 外標(biāo)一點(diǎn)法要求進(jìn)樣量準(zhǔn)確及測試條件恒定。SSXXCAAC 實(shí)例實(shí)例1 兔血漿中丹皮酚的高效液相色譜法測定兔血漿中丹皮酚的高效液相色譜法測定 按按 本例采用HPLC內(nèi)標(biāo)測定法，請注意內(nèi)標(biāo)物苯乙酮選擇的基本要求苯乙酮選擇的基本要求： 其在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被測物質(zhì)丹皮酚丹皮酚相似，但又非原樣品中所含有的組分， 兩者的保留時間相近，但又能完全分開。 因丹皮酚丹皮酚具有揮發(fā)性，故在血樣處理時采用了乙腈沉淀法。結(jié)果較為滿意，可供類似成分藥物動力學(xué)研究參考。 1.1.實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)部分 1.11.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制備標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取丹皮酚4mg置25ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度(0.16mg/ml)。分

13、別吸取5、10、20、40、80、120l置具塞離心管中，分別加入苯乙酮溶液15l；加兔血漿1ml，乙腈5ml，補(bǔ)加蒸餾水至8ml，混勻，離心(2000r/min)15min。上層液通過SPE C18，取收集液進(jìn)樣20l，測量峰高，計(jì)算丹皮酚與苯乙酮的峰高比。用最小二乘法回歸，得濃度對峰得濃度對峰高比的回歸方程高比的回歸方程為：1.2兔血漿中丹皮酚濃度的測定兔血漿中丹皮酚濃度的測定 丹皮酚溶液的制備：稱取丹皮酚300mg，以無水乙醇10ml溶解，再加1,2-丙二醇7ml混合。此液逐漸加到滅菌蒸餾水中至30ml，過濾。濾液于100，30min滅菌即得。 Y = 15.151X - 0.00382

14、 (n=6)， r =0.9973 選擇體重在2.5kg以上New Zaland兔3只， 按30mg/kg由耳靜脈注射丹皮酚溶液耳靜脈注射丹皮酚溶液， 然后在2、5、15、20、30、45、60、90、120、180、240和360min時取血取血，并立即離心(2000 r/min)10min，分離血漿。 分別取上述各時間的血漿1ml，置具塞離心管中，加乙腈5ml，苯乙酮溶液15l，混合后補(bǔ)加蒸餾水至8ml，混合。其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下。 測定丹皮酚與內(nèi)標(biāo)物的峰高比，代入回歸方程計(jì)算血藥濃度（見表7-18），并繪制藥-時曲線（見圖7-9）。 對3只家兔靜注后6h體內(nèi)丹皮酚血漿濃度測定的數(shù)據(jù)用計(jì)

15、算機(jī)按兩室模型進(jìn)行處理，得藥物動力學(xué)參數(shù)（見表7-19）。 表表7-18 靜注后不同時間兔血漿中丹皮酚濃度靜注后不同時間兔血漿中丹皮酚濃度 濃度（ug/ml血漿） 時間（min） No 1 No 2 No 3 平均 2 33.03 32.60 31.20 32.48 5 18.80 17.53 13.92 16.75 10 16.30 16.99 11.94 15.08 15 12.99 11.19 9.15 11.11 20 10.83 8.29 8.45 9.19 30 9.20 8.02 7.28 8.17 45 8.53 7.76 6.41 7.56 60 6.70 6.24 5.75

16、 6.17 90 3.79 3.97 3.29 3.62 120 3.35 3.23 2.76 3.11 180 1.25 1.31 1.21 1.26 240 0.90 0.98 0.97 0.95 360 0.78 0.87 0.82 0.82 表表7-197-19 靜脈注射丹皮酚溶液兔體內(nèi)藥物動力學(xué)參數(shù)靜脈注射丹皮酚溶液兔體內(nèi)藥物動力學(xué)參數(shù) K12 K21 K10 T1/2（） T1/2（） V Q AUC （h-1） （h-1） （h-1） （h） （min） （L） （ L/h） （hg/ml） 1 0.5903 0.6382 0.9512 2.1141 22.45 16.22 5.

17、32 23.13 2 1.6781 0.3407 1.0311 5.7798 14.19 53.72 6.44 18.63 3 0.6296 0.5865 0.8114 2.5581 23.67 21.96 5.85 20.52 平均 0.966 0.5218 0.9312 3.484 20.10 30.63 5.87 20.76 2. 2. 討論討論 通過殘數(shù)平方和與擬合度計(jì)算，丹皮酚靜脈注射給藥為雙室模型。 分布半衰期僅20min，說明該藥進(jìn)入體內(nèi)很快分布到有關(guān)器官和組織，迅速發(fā)揮藥效。 消除半衰期是3.5h左右，表明在體內(nèi)停留時間不長。 從藥物動力學(xué)參數(shù)可以看出，丹皮酚在兔體內(nèi)動力學(xué)參數(shù)

18、存在一定的個體差異。實(shí)例實(shí)例2 2 三維三維HPLCHPLC等四譜研究川芎伍用丹參煎劑對等四譜研究川芎伍用丹參煎劑對川芎嗪藥物動力學(xué)的影響川芎嗪藥物動力學(xué)的影響 中藥復(fù)方成分復(fù)雜，特異性是其濃度測定方法的難點(diǎn)，本例選用多種先進(jìn)分析儀器，較好的地決了這一問題。對比分析圖（7-10）A、B、C所示各峰形，結(jié)合結(jié)果部分文字說明，體會實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的思路。其中關(guān)于如何判斷樣品預(yù)處理去除蛋白的效果，以及關(guān)于四譜鑒定樣品來源的確認(rèn)都具有一定的啟迪作用。 1.實(shí)驗(yàn)方法(略)2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 TMP和內(nèi)標(biāo)安眠酮的保留時間分別為3.992min和6.223min，見圖（7-10）?？瞻籽迳V圖為A部分；灌胃川

19、芎煎劑后取血清經(jīng)處理色譜圖見C部分；說明樣品預(yù)處理去蛋白效果好，血清中TMP和內(nèi)標(biāo)沒有雜峰干擾（B部分）；灌胃川芎煎劑后圖中的1號蜂為TMP，與未知的6、7峰較好分離（C部分）；灌胃川丹合劑后在5與6號峰之間增加一新的峰（未列圖）。 空白雙蒸水與川芎煎劑的三維色譜圖（體外）比較后表明：TMP一個峰出現(xiàn)在保留時間（Rt）為2.98min、紫外吸收波長（UV）為280nm處；另一峰出現(xiàn)在Rt 2.98min、UV 210nm處并與雜峰重疊。 空白血清、川芎煎劑（體外）與川芎煎劑（30g/kg）灌胃大鼠后1m1血清樣品三維色譜圖比較表明：TMP峰Rt和UV一致，但峰形較低；B峰（Rt 18min，U

20、V 220nm，從圖上分析該處至少有2個峰，但難以分開）降低后另外出現(xiàn)一峰（Rt 2.2min，UV300nm）；A與C峰則消失。 2.2 2.2 四譜鑒定結(jié)果：四譜鑒定結(jié)果： 紫外：紫外：maxH2O288nm； 紅外光譜：紅外光譜：3000，1455，1420，1370，1240，1210，1195，1005，815cm-1； 核磁共振氫譜：核磁共振氫譜：呈現(xiàn)甲基峰2.45（單峰）； 質(zhì)譜：質(zhì)譜：（分子離子峰136）主要碎片有m/e95（CH3CNCCH3=CCH3），m/e54（CH3CCCH3+），m/e42（CH3CNH+ ），m/e39（CH3CC+） 綜合分析以上數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)報道

21、的TMP基本符合，證明大鼠灌胃川芎煎劑后血清中所提取的1號組分即為TMP，其他組分還待進(jìn)行解析。 2.32.3 健康Wister 大鼠灌胃川芎煎劑與川丹合劑后不同時間血清藥物濃度，見表（7-20）；藥物動力學(xué)參數(shù)（一級吸收速率常數(shù)（Ka），半吸收期（T1/2Ka），血藥-時曲線下面積（AUC）見表（7-21）。 表表7-20川芎煎劑和川丹合劑灌胃大鼠后不同時間川芎煎劑和川丹合劑灌胃大鼠后不同時間血清藥物含量比較（ s） 血清藥物含量（ug/ml） 組 別 0.08h 0.25h 0.50h 0.75h 1.00h 1.50h 2.00h 3.00h 5.00h 川芎煎劑 0.652 0.874

22、 0.592 0.475 0.363 0.299 0.243 0.148 0.053 s 0.487 0.180 0.271 0.248 0.262 0.103 0.112 0.079 0.031 川丹煎劑 0.468 0.571 0.392 0.330 0.235 0.178 0.166 0.088 0.034 s 0.081 0.231* 0.184 0.178 0.125 0.061* 0.083 0.061 0.013 注：兩組各6只大鼠；與川芎煎劑比較 * P 0.05xxx 表表7-21 健康大鼠一次川芎煎劑、川丹合劑灌胃健康大鼠一次川芎煎劑、川丹合劑灌胃川芎嗪川芎嗪藥物動力學(xué)參數(shù)

23、比較（ s） Ka K10 K12 K21 T1/2Ka t1/2 t1/2 AUC Vc/F 組別 （ h-1 ） （h） （ugh/ml）（L/kg） 川芎煎劑 1.928 0.479 19.580 1.090 0.470 0.847 0.036 0.354 1.448 1.273 9.665 s 0.719 0.205 4.139 0.502 0.160 0.247 0.024 0.101 0.880 0.255 1.810 川丹煎劑 2.328 0.479 11.508 0.738 0.205 1.511 0.060 0.298 1.447 0.836 7.390 s 0.719 0.

24、289 2.821* 0.255 0.092 0.471* 0.020 0.223 0.901 0.168* 1.089* 注：兩組各6只大鼠；與川芎煎劑比較 * P 0.05，* P 0.01xxx3. 3. 討論討論3.13.1 傳統(tǒng)二維HPLC法研究單體化合物時，僅以對照品與樣品色譜峰是否保留時間一致及峰形重疊來定性，是嚴(yán)謹(jǐn)，因?yàn)橐粋€峰也可能是分離不開的兩個化合物；川芎煎劑成分復(fù)雜，更造成定性錯誤。本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列的3D-HPLC和四譜方法鑒定，更加科學(xué)和精確。 3.2 3.2 川芎湯劑體內(nèi)外化學(xué)成分分析：川芎湯劑體內(nèi)外化學(xué)成分分析：3D-HPLC測定時較2D-HPLC的測定結(jié)果多一

25、個未知化合物，說明三維多信息檢測的優(yōu)勢，且川芎湯劑的化學(xué)成分在體內(nèi)外有所變化。在川芎煎劑給大鼠灌胃后血清樣品的三維色譜圖中少一種組分，可能是由于三氯甲烷萃取時丟失所致。所以仍需進(jìn)一步完善樣品預(yù)處理方法以更真實(shí)地反映血中川芎煎劑化學(xué)成分的變化。3.3 3.3 川芎煎劑與川丹合劑比較川芎煎劑與川丹合劑比較：（1）0.25h:血藥濃度 1.53倍倍 AUC值 1.52倍倍， 說明川丹合劑生物利用度低，是丹參干擾拮抗導(dǎo)川丹合劑生物利用度低，是丹參干擾拮抗導(dǎo)致致“相惡相惡”效應(yīng)。效應(yīng)。（2）Ka、t1/2Ka值川芎煎劑川丹合劑組，由于丹參伍用由于丹參伍用導(dǎo)致導(dǎo)致TMPTMP吸收減慢。吸收減慢。 這有助于

26、解釋臨床較少以川芎單獨(dú)伍用丹參的原臨床較少以川芎單獨(dú)伍用丹參的原因。因。 以上為我們提出的“復(fù)方藥物動力學(xué)”假說提供了初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 這種伍用丹參“相惡相惡”效應(yīng)， 一方面是共煎時川丹合劑中TMP與川芎煎劑相比僅僅81.52%81.52%溶出溶出，即這種“相惡”發(fā)生于體外體外； 另一方面則是由于增加丹參等于增加了多種化學(xué)成分在體內(nèi)干擾體內(nèi)干擾，其機(jī)制十分復(fù)雜，有待進(jìn)一步探討。機(jī)制十分復(fù)雜，有待進(jìn)一步探討。三、免疫法三、免疫法 免疫法是七十年代發(fā)展起來的新的檢測技術(shù)，免疫法是七十年代發(fā)展起來的新的檢測技術(shù)， 用于體內(nèi)藥物的分析具有以下特點(diǎn)用于體內(nèi)藥物的分析具有以下特點(diǎn): : 取樣量小，取樣量小，

27、 專一性強(qiáng)，專一性強(qiáng)， 靈敏度高。靈敏度高。 常有以下兩種方法：常有以下兩種方法： 放射放射免疫法（免疫法（RIARIA） 酶酶免疫法（免疫法（EMIAEMIA），）， 它們的它們的檢測限可達(dá)檢測限可達(dá)0.001ng0.001ng。放射免疫法放射免疫法 含義：含義：一種將放射性同位素技術(shù)與免疫化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的體外測定超微量（10-9_10-10g）物質(zhì)的新技術(shù)。 它兼有這兩種技術(shù)的特征： 同位素技術(shù)的高靈敏度、精確性 抗原抗體免疫反應(yīng)的專一性 這一分析技術(shù)已發(fā)展成為一門獨(dú)立的方法學(xué)學(xué)科，在蛋白質(zhì)、多肽激素以及某些非激素、癌相關(guān)抗原等的測定方面有廣泛的應(yīng)用。 基本原理：基本原理：是一種竟?fàn)幮越Y(jié)合

28、反應(yīng)。 將高度純化的待測藥物標(biāo)準(zhǔn)品待測藥物標(biāo)準(zhǔn)品作為抗原（抗原（AgAg）免疫動物，使其產(chǎn)生特異性抗體（抗體（AbAb），）， 然后將待測藥物標(biāo)準(zhǔn)品用放射性同位素（3H、131I、125I、13C等）標(biāo)記成標(biāo)記抗原（標(biāo)記抗原（* *AgAg），）， 再將* *AgAg、 待測藥物AgAg（為非標(biāo)記抗原） 混合培育混合培育， 和抗體AbAb 使競爭性結(jié)合反應(yīng)競爭性結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡平衡。 其基本反應(yīng)如下： *Ag *Ag-Ab + *Ag Ag Ag-Ab + Ag *Ag和Ab的量保持恒定（人為控制），當(dāng)*Ag與Ag之和大于Ab上有效結(jié)合點(diǎn)數(shù)目時，Ag和*Ag 就要爭奪Ab來結(jié)合成相應(yīng)的*Ag-

29、Ab （結(jié)合標(biāo)記抗原）和Ag-Ab（結(jié)合非標(biāo)記抗原）。 +Ab 反應(yīng)達(dá)到平衡平衡時，反應(yīng)產(chǎn)物中* *Ag-AbAg-Ab量量的多少隨著隨著AgAg（樣品中待測物的濃度）的量而改變（樣品中待測物的濃度）的量而改變的。 Ag量越大，競爭Ab的機(jī)率比*Ag 競爭Ab的幾率越大，形成*Ag-Ab量就越少。 Ag量越小，競爭Ab的幾率也相應(yīng)減少，形成*Ag-Ab的量就越多。 將Ag量與*Ag-Ab量之間的數(shù)量關(guān)系作成曲線競爭結(jié)合曲線，就是放射免疫分析定量的基礎(chǔ)。 競爭結(jié)合曲線的表示方法：競爭結(jié)合曲線的表示方法： B: B: *Ag-Ab F: F: *Ag 縱坐標(biāo)縱坐標(biāo)標(biāo)記抗原*Ag的結(jié)合率結(jié)合率B/F

30、B/F（結(jié)合狀態(tài)放射性B與游離狀態(tài)放射性F的比值）， 或結(jié)合百分率結(jié)合百分率B%B%（結(jié)合狀態(tài)的放射性B占總放射性（B+F）的百分?jǐn)?shù)）； 橫坐標(biāo)橫坐標(biāo)待測藥物（非標(biāo)記抗原Ag）的對數(shù)濃度。 樣品的測定：樣品的測定： 測定未知樣品中Ag含量時，n用待測藥物標(biāo)準(zhǔn)品配制一系列Ag，作出標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合曲線；n根據(jù)未知樣品得到的B/F或B%從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)待測樣品中Ag的量。 使用放射免疫法（使用放射免疫法（RIARIA）的必需條件：）的必需條件：（1）高純度比放射性同位素標(biāo)記抗原抗原；（2）特異性抗體抗體；（3）有效的分離方法分離方法: 結(jié)合標(biāo)記抗原（* *Ag-AbAg-Ab） 與 分離(以分別計(jì)數(shù))

31、 非結(jié)合標(biāo)記抗原（* *AgAg） 實(shí)例實(shí)例 黃夾次苷甲和次苷乙的放射免黃夾次苷甲和次苷乙的放射免疫測定及其藥物動力學(xué)疫測定及其藥物動力學(xué) 結(jié)合本例，可將放射免疫法研究藥動學(xué)的主要步結(jié)合本例，可將放射免疫法研究藥動學(xué)的主要步驟總結(jié)如下：驟總結(jié)如下： （1）準(zhǔn)備待測藥物標(biāo)準(zhǔn)品、放射性同位素，配制專用測定試劑；n 標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原：用氚爆射法將3H標(biāo)記在黃夾次苷乙上；n 制備特異性抗體制備特異性抗體：在家兔上注射活卡介苗，兩周后注射抗原乳化液，使生成特異性抗體（抗血清）。 （2）實(shí)驗(yàn)動物給藥給藥（黃夾次苷乙），不同時間點(diǎn)采集血樣采集血樣；（3）將抗體、動物血漿、放射性標(biāo)記抗原混合，在一定條件下培育

32、，使競爭性結(jié)合反應(yīng)競爭性結(jié)合反應(yīng)完全；（4）分離分離結(jié)合標(biāo)記抗原和游離標(biāo)記抗原，測定放射性，計(jì)算計(jì)算，即得。其流程簡述如下： 待測Ag樣品液（即待測血樣） 標(biāo)準(zhǔn)Ag液 （標(biāo)準(zhǔn)品黃夾次苷乙+空白血樣） 加入抗體Ab加標(biāo)記抗*Ag 分離 測定放射性 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程 由標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程求含量 求算藥物動力學(xué)參數(shù) 1.1.實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法( (略略) ) 2.2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.1 2.1 抗體鑒定抗體鑒定 2.1.1 2.1.1 抗體滴度和標(biāo)準(zhǔn)曲線：抗體滴度和標(biāo)準(zhǔn)曲線：免疫三個月后兔體內(nèi)已產(chǎn)生抗體，六個月后滴度達(dá)1:800左右。用此抗體作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖7-20所示。 2.1.2 2

33、.1.2 抗體的特異性和測定靈敏度：抗體的特異性和測定靈敏度： 類似化合物間的交叉反應(yīng)按下式計(jì)算： Y50和E50分別為兩個化合物的半數(shù)抑制量 %100%5050EY）交叉反應(yīng)率（如圖7-21所示，抗體與次苷乙的交叉反應(yīng)率約為100%，與單乙酰次苷乙的交叉反應(yīng)率較?。?0%），與地高辛的交叉反應(yīng)率僅為0.4%，與皮質(zhì)酮的交叉反應(yīng)率則低于0.2%。 2.2 2.2 測定條件測定條件2.3 2.3 黃夾苷成分的生物利用度黃夾苷成分的生物利用度 將豚鼠豚鼠隨機(jī)分為6組（每組34只）,靜脈注射或灌胃次苷甲、次苷乙或強(qiáng)心靈后的血藥時程見圖7-22和7-23。 由圖可見，次苷甲次苷甲和次苷乙次苷乙在動物體

34、內(nèi)的動力學(xué)行為符合線性二室模型，二室模型，藥物動力學(xué)參數(shù)如表7-28所示。表表7-28 豚鼠單次靜注或灌胃次苷甲、次苷乙后的藥動學(xué)參數(shù)豚鼠單次靜注或灌胃次苷甲、次苷乙后的藥動學(xué)參數(shù)(180ug/kg) 次苷甲 次苷乙 參數(shù) 靜注 口服 靜注 口服 A(ng/ml) 321.23 12.34 221.98 9.22 B(ng/ml) 25.69 20.75 (h-1) 5.23 3.73 (h-1) 0.33 0.10 T1/2(h) 0.13 0.23 0.19 0.09 T1/2(h) 2.13 2.55 6.79 7.04 K12(h-1) 2.39 2.51 K21(h-1) 4.87 3.41 Ke(h-1) 2.47 0.27 0.90 0.10 Ka(h-1) 3.06 7.76 V1(L/kg) 0.52 0.77 Vd(L/kg) 3.94 16.01 6.78 19.76 AUC(ug/h/kg) 140.38 41.40 260.04 92.50 CL(L/kg/h) 1.28 4.35 0.69 1.95 Tm(h) 0.87 0.57 Cm(ng/ml) 8.88 8.61 Lag time(min) 0.00 0.02 3. 3. 討論討論 實(shí)驗(yàn)表明，所制備的抗體特異性較高，和地高辛及皮質(zhì)酮的交叉反應(yīng)小，與單乙酰次