根據(jù)浮力密度并應(yīng)用密度依賴的細胞分離技術(shù)對海生細菌

1、根據(jù)浮力密度并應(yīng)用密度依賴的細胞分離技術(shù)對海生細菌分類和初步鑒定簡介 本次研究的目的是測試一些天然海生細菌種群是否存在獨特的的浮力密度，從而可以用密度依賴的細胞分離（DDCS）方法來分離。 我們首先濃縮一個天然細菌集合體來收集足夠數(shù)量的細胞。我們用DDCS方法把它們分成三部分，每部分的群落結(jié)構(gòu)由熒光原位雜交分開。 古生菌細胞趨向于出現(xiàn)在高濃度部分，反之那些噬細胞菌屬-產(chǎn)黃菌屬-擬桿菌屬在低的濃度部分。前言 浮力密度是一個單細胞水生生物體的基本物理特征，例如浮游植物和細菌。 對浮游植物來說，在考慮沉積速度的時候這個參數(shù)也必須被考慮進去。 但是對于海生細菌并不需要考慮浮力密度，因為海生細菌的浮力密

2、度的意義并不明顯。 浮力密度的不同能被用來分離微粒，DDCS方法已經(jīng)被應(yīng)用于實驗室細菌培養(yǎng)。前言 不同生理特征的細菌利用這個方法得到了成功分離，因為生理的變化可以改變細胞的組分以致于浮力密度。 因為天然海水的營養(yǎng)水平通常較低，并且恒定（大約1mg/L），所以沒有或者很少有細胞處在符合實驗室培養(yǎng)過程中的指數(shù)期的生理狀態(tài)，而且在天然細菌群體中，生理狀態(tài)的變化不像包含延遲期，對數(shù)期，穩(wěn)定期的分批培養(yǎng)的細菌那么的大。前言DDCS的方法是很有說的方法是很有說服力和應(yīng)用前景的！服力和應(yīng)用前景的！材料和方法 表層海水預(yù)過濾（3微米）超濾（2微米） 密度梯度離心分離不同密度的菌體 FISH 觀察和計數(shù)材料和方

3、法樣品的采集 我們用已經(jīng)消毒過的塑料桶在一個名為Aburatsubo 小港口 (北緯3509.5, 東經(jīng)13936.5; Sagami Bay, Japan) 的地方于2004年6月28日，2004年10月25日，2005年1月24日，2005年4月18日分別取得4升表層海水。材料和方法預(yù)過濾 這些樣品通過微孔聚碳酸酯過濾器(直徑47毫米; 孔直徑3.0微米; 型號 PC MB 111112; Whatman, Middlesex, United Kingdom)預(yù)過濾。材料和方法超濾 然后，這些經(jīng)過預(yù)過濾的樣品經(jīng)過另一種微孔聚碳酸酯過濾器(直徑90毫米; 孔直徑2.0微米; 型號 PC MB

4、 111706; Whatman)進行超濾，超濾裝置的型號為：(UHP-90K;Advantec, Tokyo, Japan)。 超濾的環(huán)境中充滿了氮氣，壓力為1MPa。樣品被濃縮至原濃度的133200倍。 經(jīng)過不到4個小時的上述過程之后，這些樣品被保存在零下4攝氏度的環(huán)境中。材料和方法密度梯度離心 我們使用了一種名為Percoll (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) 的梯度工作溶液，這種溶液含有6163的Percoll，10的4M NaCl 溶液，10的10磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），以及1719的蒸餾水。材料和方法密度梯度離心 接著我們?nèi)〕龊辽?/p>

5、這種工作溶液，將毫升的我們的樣品置于該工作溶液的表面，然后將這種混合液使用SW40 Ti 轉(zhuǎn)頭 (Beckman, CA) in a Beckman Optima XL-90 離心機在50,512 g and 4攝氏度下超速離心分鐘 經(jīng)過超速離心后, 通過使用Piston 梯度分餾器 (Biocomp, Fredericton, Canada)這些樣品被分成上，中，下三層。材料和方法細菌數(shù)量的計數(shù) 每層分別用高壓蒸汽滅菌過的，而且用微米孔徑的過濾器過濾過的人造海水稀釋，然后被終濃度為的多聚甲醛固定。 在用（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色后，細胞的數(shù)量通過熒光顯微鏡(BH-2; Olympu

6、s, Tokyo, Japan) 計數(shù)出來。材料和方法細菌種類的鑒定 每個被分層的樣品被Isopore聚碳酸酯過濾器(直徑25毫米; 孔徑 0.2 微米; type GTTP 02500; Millipore, Eschborn, Germany) 過濾，過濾條件為真空。 這些過濾器和樣品在過濾操作之前都置于零下攝氏度的環(huán)境中。材料和方法FISH 每個過濾器被切成了個片斷，然后放置在載玻片上，并用封口膜(American National Can,Chicago, IL)覆蓋，而且用含有微升雜交緩沖液（表）和微升的含有納克每微升的上述寡核苷酸片斷的探針的共微升的混合溶液覆蓋。材料和方法FISH

7、 在攝氏度的溫箱中恒溫培養(yǎng)了分鐘后，上述過濾器被轉(zhuǎn)入到一個含有攝氏度洗脫液的小瓶中，并在攝氏度下培養(yǎng)分鐘。接著將這些過濾器取出，放置于Toyo濾紙(Advantec)上晾干，然后放置在封口膜上，并用微升的溶液（經(jīng)過0.2微米孔徑過濾的以蒸餾水溶解的終濃度為1微克每毫升）浸泡，注意這個過程是在室溫和黑暗條件下進行的。材料和方法FISH 然后這些過濾器被輕輕的用毫升的微米過濾過的蒸餾水清洗，接著在Toyo濾紙上晾干，在載玻片上用Citifluor AF1 (Citifluor Ltd., Canterbury, UnitedKingdom) 制成標本裝片。 在雜交之后，過濾器片斷上的細菌可以通過熒

8、光顯微鏡(BH-2; Olympus)和過濾器接收機計數(shù)出來。 對于每個樣品和探針，至少菌落和多于個細胞被數(shù)出來。所有的數(shù)量可以通過減去NON338 探針這一陰性對照來校正。實驗結(jié)果細胞濃縮效率：由濃縮前后海水中細胞個數(shù)的百分數(shù)比率表示。DAPI陽性細胞：可以被DAPI染色，從而能通過熒光顯微鏡進行計數(shù)的細胞?！翱偧毦保涸趯嶒炛兴心鼙籇API染色的細菌。實驗并沒有把注意力放在細菌形態(tài)大小的不同上。每組樣品中，由不同染料或探針所測得的細胞濃縮效率所用染料或探針細胞濃縮效率（）七月十月一月四月DAPI88929396ALF91696769792BET42a96769896GAM42a84839

9、999CF319a82669794ARCH91584848894EGB33899999699實驗結(jié)果實驗結(jié)果由上表可以看到：DAPI陽性細胞的細胞濃縮效率分布由88至96。若從不同的染料或特定探針效果來看濃縮效率則從66（2004年10月25日， CF319a ）分布到100（2005年1月24，GAM42a）。（平均值91，標準偏差9.2，變異系數(shù)10，樣本總體N24）在濃縮過程中沒有改變相關(guān)種群相對的數(shù)量關(guān)系。實驗結(jié)果 每一樣品根據(jù)浮力密度被分成上、中、下三部分： 上1.074 g/ cm3 。 對于四個樣品，分餾前的三部分的“總細菌”占總體細菌的49到71（平均61，標準偏差9.1，變異

10、系數(shù)15）。 實驗結(jié)果用染劑或探針所顯示的各部分的比例實驗結(jié)果由上圖左部分的DAPI可以做出下表：各個部分在“總細菌”所占的比例（）標準偏差（）變異系數(shù)（）分布平均值上層2648409.524中層1654321650下層2041299.231實驗結(jié)果上圖右部分的探針測試：實驗收集了四個不同季節(jié)的樣品，在所有的使用探針的樣品中的變異系數(shù)為0.2413 。我們發(fā)現(xiàn)在相關(guān)的細菌種群中存在一種趨勢：屬于噬細胞菌屬-產(chǎn)黃菌屬-擬桿菌屬的更集中于上層部分低濃度部分，而古生菌細胞趨向于出現(xiàn)在下層部分即高濃度部分。Discussion 從天然海水中富集的的細胞用DDCS的方法被分成三部分，每部分的群落結(jié)構(gòu)可通

11、過熒光原位雜交（FISH）來證實。古生菌的細胞傾向于出現(xiàn)在高密度部分，CFB細胞出現(xiàn)在低密度的部分。這個結(jié)果顯示一些分類學(xué)群體有著獨特的浮力密度。細胞富集 : 對于DDCS方法，一毫升樣品加在工作溶液的表面。對于有著不同類探針的FISH，為了得到足夠數(shù)量的細胞，很必要在實驗步驟前富集細胞。在預(yù)先的調(diào)查之后，我們決定得到一個密度大約為每毫升108個細胞的懸浮液，這需要100-200倍濃縮的天然海水樣品。目前方法的富集效率大約為90%，這種效率適合于切向流系統(tǒng)培養(yǎng)的埃希氏大腸桿菌。我們發(fā)現(xiàn)不同的探針特異的組之間的富集效率差別很小，說明在富集過程中沒有差別。在這項研究里，用DDCS分離樣本后再應(yīng)用熒

12、光原位雜交法，是因為在培養(yǎng)依賴的技術(shù)中，這種方法能提供最可信的數(shù)據(jù)資料。如果有另一種需要較少細胞的方法被應(yīng)用，細胞富集的程序被可以省去。 DDCS應(yīng)用于自然海生細菌群落： 在以前的研究中，DDCS被專門應(yīng)用到在實驗條件下培養(yǎng)的細菌細胞中。依靠INT將DDCS應(yīng)用于自然細菌群體是專門為了增加有益活生菌的密度；因此不是依靠自然群落的浮力密度的差別。當應(yīng)用于自然的聚集體時，用DDCS分離細胞應(yīng)該僅僅依靠它們的浮力密度，而不是其他的因素如細胞大小和凝集。如果在目前的超速離心法的條件下，沉降平衡沒有被建立，這些因素會明顯影響結(jié)果。假設(shè)細胞直徑是0.3m ,浮力密度是1.087g/cm3,在目前的超速離心

13、狀態(tài)下細胞會移動163mm。因為密度為1.087g/ cm3的浮力標記珠位于距測試管表面65mm處，沉降平衡應(yīng)該在超速離心式間段內(nèi)建立。細胞的形狀也不會造成什么影響，因為軸比為20的長橢球在我們的超速離心狀態(tài)下會移動82mm。因此，細胞大小，形態(tài)和聚集狀態(tài)等因素很難影響到當前的結(jié)果。顯微觀察也支持這個觀點。 海生古生菌和真細菌的浮力密度： 應(yīng)用DDCS，我們發(fā)現(xiàn)屬于噬細胞菌屬-產(chǎn)黃菌屬-擬桿菌屬（CFB）的自由生長細胞的浮力密度（分散在頂部）比自由生長的古生菌細胞的浮力密度低（底部）。這個發(fā)現(xiàn)與這些群落在自然海水中的分布相符。由于浮游植物，CFB細菌傾向于生活在表面，而古生菌占據(jù)了一半以上深海

14、細菌，尤其是在1000m以下。雖然古生菌細胞的細胞膜普遍由阿克醇和卡克醇組成，而真細菌的細胞膜由油脂構(gòu)成，究竟哪種細胞特征解釋了浮力密度的不同還不清楚。因此生物化學(xué)研究也許能解釋影響浮力密度的因素。在這項研究中我們無法找到其它親緣群體的浮力密度變化趨勢，可能是由于它們是具有生理差別的細胞的混合體，也許是由于每一個群落都包含了具有廣泛密度特征的亞群組成。細菌沉降速率計算： 因為這個工作提供了第一手的海生細菌群落浮力密度的數(shù)據(jù)資料，我們同時用Stoke定律估計了它們的沉降速率。對于海生細菌和海水我們做了如下假設(shè)：細胞是直徑為0.3 m的球體；低，中，高密度細菌的浮力密度分別是1.047，1.067，1.087，海水的密度是1.027 g/cm3,這時的海水溫度是5。在這個假設(shè)的基礎(chǔ)上，低，中，高密度的細菌的沉降速率分別是10，20和30m/h-1,這些數(shù)值在20時增長1.5倍。這個沉降速率很小，海生細菌實際上不能在擁有與我們計算中的假設(shè)所不同的物理化學(xué)因素和密度的水團或水流中移動。然而，大約1030m h-1的沉降速率說明細胞能被重力作用影響，這正解釋了它們的垂直運動。近期研究結(jié)果顯示微尺度為（2，16，17，18）的細胞存在異向分布。依賴于浮力密度的細菌沉降速率可能導(dǎo)