不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場(chǎng)作用下對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

1、不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場(chǎng)作用下對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響         11-03-24 10:11:00     編輯：studa20                  作者：居會(huì)祥, 戴真煜, 孫明忠, 呂晶晶 【摘要】  目的： 研究不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場(chǎng)作用

2、下對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方法： 采用共沉淀法制備得到不同粒徑FeOx，將不同粒徑FeOx吸附于細(xì)胞表面，并加載靜磁場(chǎng)(SMF)及100 Hz交變磁場(chǎng)(EMF)照射。運(yùn)用CCK8檢測(cè)納米粒子吸附后在外加磁場(chǎng)作用下Bel7402細(xì)胞增殖情況，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、死亡率及細(xì)胞周期變化。結(jié)果： 不同粒徑磁性納米FeOx在SMF照射時(shí)間低于72 h時(shí)能使Bel7402細(xì)胞增殖速度增快，當(dāng)照射時(shí)間大于72 h時(shí)，細(xì)胞增殖速度未發(fā)生明顯變化但部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡率為(3.1±0.78)。而經(jīng)EMF照射后37 nm FeOx吸附細(xì)胞增殖被抑制，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大部分細(xì)胞被阻滯在G

3、0/G1期，細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡與凋亡，凋亡率達(dá)到(23.34±3.6)、死亡率達(dá)到(57.24±2.7)。結(jié)論： 納米粒子未有外加磁場(chǎng)照射時(shí)不能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的影響，外加SMF照射時(shí)，細(xì)胞的增殖及DNA代謝未發(fā)生明顯的變化，但細(xì)胞發(fā)生凋亡；外加EMF照射時(shí)，細(xì)胞增殖被抑制并發(fā)生明顯的凋亡及死亡，細(xì)胞DNA代謝明顯紊亂，且具有較小粒徑的磁性納米FeOx在EMF作用下對(duì)肝癌細(xì)胞影響最為顯著。 【關(guān)鍵詞】  磁性納米FeOx； 增殖； 凋亡； DNA周期AbstractObjective: To study the effects of different diamete

4、rs of nano FeOx powders on proliferation and DNA metabolism of heptomacell lines Bel7402.Methods： Different diameters of nano FeOx powders were utilized to dope the heptomacell lines Bel7402 through the coprecipitation meanings, then cells were exposed by static magnetic field(SMF) and extremely low

5、 frequency altering magnetic field(EMF) with 100 Hz. After exposed by external fields, CCK8 kit was used to detect the effects on proliferation of cells caused by nano powders. Apoptosis kit and DNA cycle kit was used to detect the effects caused by nano FeOx of cell apoptosis, death and cell DNA cy

6、cle metabolism. Results： Different diameters nano FeOx could not influence the cell at all under SMF exposure but could influence the cells under EMF, when the diameter was 37 nm the highest apoptosis and death ration were (23.34±3.6) and (57.24±2.7)%, respectively, and the most of cells w

7、ere prohibited in G0/G1 period of DNA cycle.  Conclusion： nano powders could not influence the cells at all without external magnetic field exposure. Under SMF exposure the proliferation and DNA metabolism of cells absorbing by nano powders were not influenced, but the apoptosis ratio of cells

8、was increased. After exposure by EMF cells absorbing by nano powders could be affected in proliferation, apoptosis and DNA metabolism，furthermore, all the effects were more obvious in the cells absorbing by nano powders with little diameter under EMF exposure.Key wordsmagnetic nano FeOx； proliferati

9、on； apoptosis； DNA cycle   磁性納米材料具有良好的磁導(dǎo)向性、較好的生物相容性、生物降解性和活性能基團(tuán)等特點(diǎn)1-3，它可結(jié)合各種功能分子，如酶、抗體、細(xì)胞、DNA或RNA等，因而在靶向藥物、控制釋放、酶的固定化、免疫測(cè)定、DNA和細(xì)胞的分離與分類(lèi)等領(lǐng)域可望有廣泛的應(yīng)用。磁性納米材料特別是Fe屬納米顆粒已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于藥物靶向治療及干細(xì)胞定向移植治療中4。當(dāng)粒徑在30200 nm之間時(shí)，矯頑力和飽和磁化強(qiáng)度均達(dá)到最大值，且具有單疇特性。目前已有納米磁性氧化鐵等顆粒作為藥物或干細(xì)胞載體用于肝癌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究，但對(duì)磁性納米氧化鐵粒子本體對(duì)人體研究

10、相對(duì)較少5。本研究以肝癌細(xì)胞Bel7402為對(duì)象，觀察不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場(chǎng)作用下對(duì)其生物學(xué)特性的影響，旨在為FeOx用于治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。    1  材料和方法    1.1  試劑及儀器    肝癌細(xì)胞株Bel7402購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。靜磁場(chǎng)發(fā)生儀為兩塊強(qiáng)磁場(chǎng)稀有金屬鎳/鐵永磁體，當(dāng)兩塊磁體間距為2.5 cm時(shí)其場(chǎng)強(qiáng)為0.7特斯拉（T）。TYU2002H II型特斯拉計(jì)/高斯計(jì)為上海亨通磁電科技有限公司產(chǎn)品。變頻儀(FT1000型)為南京萬(wàn)臣電子有限公司產(chǎn)

11、品，變壓器(PT800型)為上海富濟(jì)電子公司產(chǎn)品。胰蛋白酶、Primilar1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，維生素C、青霉素、鏈霉素為杭州四季青公司產(chǎn)品。CCK8試劑盒為美國(guó)ADL公司產(chǎn)品，細(xì)胞凋亡及周期試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司。FeSO4、醋酸鋅均為分析純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司。掃描電鏡(SEM)型號(hào)為HITACHIX650，X射線(xiàn)衍射儀(XRD)型號(hào)為Philips Xpert XRD system型。    1.2  方法1.2.1  磁性納米FeOx的制備 

12、;運(yùn)用共沉淀法5以FeSO4及醋酸鋅為反應(yīng)物，反應(yīng)在乙醇、水（13）混合溶劑中進(jìn)行并加入質(zhì)量百分比為2的甘油，制備得到醋酸亞鐵前驅(qū)體，前驅(qū)體粉末灼燒溫度為400，灼燒4 h后得到FeOx粉體，10 000 r/min離心30 min，得到上下兩層不同粒徑粉末，經(jīng)SEM及XRD實(shí)驗(yàn)確定其粒徑及成分組成。SEM實(shí)驗(yàn)前樣品用超聲清洗儀超聲分散10 min。XRD實(shí)驗(yàn)條件為：掃描速率為2/min，測(cè)定納米粉體XRD譜。1.2.2  磁性納米FeOx吸附細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將不同粒徑納米FeOx加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中與細(xì)胞共同培養(yǎng)。納米粒子吸附細(xì)胞方法為：將細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞濃度大于10

13、5個(gè)/ml，再將不同粒徑納米粒子加入到細(xì)胞懸液中并在恒溫?fù)u床中勻速振蕩30 min，搖床搖速為200 r/min。振蕩完成后將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)2 d后經(jīng)SEM實(shí)驗(yàn)確定磁性納米FeOx結(jié)合效率。1.2.3  細(xì)胞培養(yǎng)   細(xì)胞種植到含10FBS PIMIRIER 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，放置在37，5CO2培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)用胰蛋白酶消化細(xì)胞成細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液（PBS）1 500 r/min 15 min離心洗滌2次，用含10FBS 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后種植細(xì)胞，每次細(xì)胞種植濃度應(yīng)大于105個(gè)/ml。細(xì)胞臨時(shí)保存在-70超低溫冰箱

14、，永久保存在液氮罐中，細(xì)胞凍存液配比為DMEMFBSDMSO=721(體積比)，細(xì)胞凍存濃度應(yīng)高于106個(gè)/ml。1.2.4  磁場(chǎng)照射細(xì)胞方法 靜磁場(chǎng)(SMF)照射細(xì)胞方法為：將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于兩塊永磁體之中，同時(shí)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔12 h照射1次，每次照射30 min，直至84 h。100 Hz交變磁場(chǎng)(EMF)照射細(xì)胞方法為：將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于離工作線(xiàn)圈頂端2 cm，經(jīng)特斯拉計(jì)測(cè)量磁感應(yīng)強(qiáng)度為0.67 mT，每間隔4 h照射1次，每次照射30 min，直至40 h。照射完成后，細(xì)胞用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液進(jìn)行各種檢測(cè)。1.2.5  CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

15、 按試劑盒提供實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。首先取出96孔酶標(biāo)板，依照次序?qū)?yīng)分別加入50 l的標(biāo)準(zhǔn)品于酶標(biāo)板微孔中，分別標(biāo)記樣品編號(hào)，將50 l細(xì)胞培養(yǎng)懸液（2.5×104個(gè)/ml）加入到酶標(biāo)板中；在標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔中加入100 l的酶標(biāo)記液，36孵育1 h，將溶液傾出， PBS清洗5次后每孔加入底物A，B液各50 l，36下避光孵育反應(yīng)15 min后加入終止液50 l，終止反應(yīng)。測(cè)定450 nm的光密度值。每隔12 h重復(fù)進(jìn)行以上步驟，72 h得到細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。1.2.6  細(xì)胞凋亡、死亡及周期實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞凋亡及周期實(shí)驗(yàn)均在流式細(xì)胞儀上完成，均按試劑盒提

16、供實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。凋亡實(shí)驗(yàn)方法為：將細(xì)胞用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，并用PBS洗滌2次并將細(xì)胞濃度重懸調(diào)整為106個(gè)/ml。染色過(guò)程為首先用微量移液槍移取20 l細(xì)胞懸液，然后用AnnexinV加入到細(xì)胞懸液中并避光靜置15 min后將PI染料加入并靜置30 min，染色完成后上機(jī)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)方法為：首先按凋亡實(shí)驗(yàn)相同方法處理細(xì)胞以待上機(jī)檢測(cè)，染色方法為將試劑盒內(nèi)A，B，C，D 4種試劑按順序分別加入到細(xì)胞懸液中，避光靜置時(shí)間均為15 min。染色完成后上機(jī)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)條件為：細(xì)胞進(jìn)樣流速中速，前向角補(bǔ)償電勢(shì)為56 V。1.2.7  統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±

17、;s表示，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，以=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2  結(jié)果    2.1  納米FeOx表征實(shí)驗(yàn)結(jié)果    SEM及XRD實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種粒子的平均粒徑分別為37，70 nm左右，粒子形狀為不規(guī)則球形（圖1，2）。根據(jù)Scherrer 公式：D=K/cos，其中D為粒子粒徑，K為形狀因子，為X 衍射的波長(zhǎng)，為衍射峰的半峰寬，為衍射角。經(jīng)XRD實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明粒子中Fe，O兩種元素的比例為11.12。圖3為2種FeOx與Bel7402細(xì)胞吸附情況，圖中FeOx為黑色顆粒，F(xiàn)eO

18、x與Bel7402細(xì)胞發(fā)生了較為明顯的吸附，37 nm粒子更易于在細(xì)胞表面吸附，表現(xiàn)為每個(gè)細(xì)胞表面吸附粒子數(shù)量明顯增加。    (a)37 nmFeOx(×30 000倍）(b)70 nmFeOx(×10 000倍)2.2  細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果    不同粒徑納米FeOx在未經(jīng)磁場(chǎng)照射時(shí)并未對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的影響，細(xì)胞經(jīng)SMF照射其增殖在磁場(chǎng)照射初期速度變快，當(dāng)照射時(shí)間超過(guò)72 h后增殖未發(fā)生明顯改變(相對(duì)對(duì)照組)。 經(jīng)EMF照射后兩種粒子吸附細(xì)胞的增殖均被抑制，當(dāng)EMF照射時(shí)間為5 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率達(dá)

19、到最大，37nm FeOx抑制率達(dá)到（76.31±2.3），70 nm FeOx抑制率為（53.56±5.2）。2.3  細(xì)胞凋亡及死亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果    從表1可見(jiàn)，凋亡率、死亡率3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明未經(jīng)磁場(chǎng)照射的納米粒子不能導(dǎo)致細(xì)胞死亡及凋亡。表2可見(jiàn)37 nm和70 nm FeOx吸附細(xì)胞經(jīng)SMF照射達(dá)到60 h后，細(xì)胞發(fā)生凋亡，當(dāng)照射時(shí)間為72 h時(shí)37 nm FeOx吸附細(xì)胞的凋亡率為（3.13±0.78），70 nm FeOx吸附細(xì)胞的凋亡率僅為（1.25±0.23）。而未經(jīng)磁場(chǎng)照射37nm FeOx吸附細(xì)胞的凋亡率為（0.01±0.03），70 nm FeOx吸附細(xì)胞的凋亡率為（0.02±0.04），未經(jīng)FeOx吸附細(xì)胞的凋亡率為（0.01±0.02）