《原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)》ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)一：大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)實(shí)驗(yàn)一：大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建及交融蛋白誘導(dǎo)表達(dá)建及交融蛋白誘導(dǎo)表達(dá)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院張忠明張忠明 朱輝朱輝 袁松麗袁松麗2021年年6月月黑曲霉的優(yōu)化培育黑曲霉的優(yōu)化培育總總DNA或或RNA的抽提的抽提PCR或或RT-PCR擴(kuò)增擴(kuò)增xynB基因基因目的基因的目的基因的TA克隆克隆質(zhì)粒質(zhì)粒pMD-xylBEcoRI+XhoI雙酶切雙酶切凝膠回收試劑盒回收目的片斷凝膠回收試劑盒回收目的片斷xynB乙醇沉淀回收線性化片斷乙醇沉淀回收線性化片斷大腸桿菌表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體pET-28(a)+ 酶連酶連酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5挑取轉(zhuǎn)化子

2、并抽提質(zhì)粒驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒挑取轉(zhuǎn)化子并抽提質(zhì)粒驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒(PCR及酶切驗(yàn)證及酶切驗(yàn)證)28S18S重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21挑取重組子挑取重組子, 用菌落用菌落PCR方法驗(yàn)證方法驗(yàn)證IPTG誘導(dǎo)促使目的大量蛋白表達(dá)誘導(dǎo)促使目的大量蛋白表達(dá)細(xì)胞破碎及蛋白抽提細(xì)胞破碎及蛋白抽提目的蛋白的純化目的蛋白的純化蛋白質(zhì)濃度測定蛋白質(zhì)濃度測定-Bradford法法目的蛋白的鑒定目的蛋白的鑒定Western biotting交融蛋白誘導(dǎo)表達(dá)流程圖交融蛋白誘導(dǎo)表達(dá)流程圖XylBCK100mM IPTG1ml LB+Kan1-I1+I2+I3+ICk+I2-I3-ICk-I37, O/N

3、37 , 2.7h37 , 2.7h37 , O/N30 , 4 h28 , 4 h1ml LB+Kan3ul 150ul3ul 3ul 3ul 50ml LB+Kan IPTG 100mM 運(yùn)用濃度運(yùn)用濃度0.1mM Kan 100mg/ml 運(yùn)用濃度運(yùn)用濃度50g/ml PBS緩沖液：緩沖液： mM NaCl 2.7mM KCl 10mM Na2HPO4 10mM KH2PO4 試劑及緩沖液：試劑及緩沖液：3SDS緩沖液：緩沖液： 187.5mM Tris-HCl (pH6.8, 25 ) 6% w/v SDS 30% 甘油甘油 0.03% w/v 溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)Gel Staining B

4、uffer(每每100ml): 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán) 250 mg 甲醇甲醇 45 ml 乙酸乙酸 10 ml 水水 45 mlGel Destaining Buffer: 甲醇甲醇 100 ml 乙酸乙酸 100 ml 加水至加水至 1000 mlSDS-PAGE膠：膠： 30%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 10% SDS 1.5M Tris-HCl pH8.8 0.5M Tris-HCl pH6.8 10% 過硫酸銨現(xiàn)配過硫酸銨現(xiàn)配 TEMEDTris-甘氨酸電泳緩沖液甘氨酸電泳緩沖液 25mmol/L Tris 250mmol/L 甘氨酸電泳級甘氨酸電泳級PH8.3 0.1% SDS 可配成可配

5、成5儲(chǔ)存液備用，在儲(chǔ)存液備用，在900ml去離子水中溶解去離子水中溶解15.1gTris堿和堿和94g甘氨酸，然后參與甘氨酸，然后參與50ml 10%w/v的電泳級的電泳級SDA儲(chǔ)存液，用去離子水補(bǔ)至儲(chǔ)存液，用去離子水補(bǔ)至1000ml。操作步驟操作步驟1： 小規(guī)模誘導(dǎo)小規(guī)模誘導(dǎo)-挑選正確表挑選正確表達(dá)克隆子達(dá)克隆子1、從平板上挑取、從平板上挑取1個(gè)個(gè)pET28-xylB/BL21轉(zhuǎn)化子接種于裝有轉(zhuǎn)化子接種于裝有2ml LB/Kan Kan濃度濃度50ug/ml培育基的培育基的PA瓶中，瓶中， 37oC， 250rpm，培育過夜；，培育過夜；2、取過夜培育物按、取過夜培育物按1%接種量分別轉(zhuǎn)接二

6、個(gè)裝有接種量分別轉(zhuǎn)接二個(gè)裝有20ml LB/Kan的的PA瓶中，瓶中，37 培育約培育約2小時(shí)小時(shí)40分鐘；分鐘；3、培育終了后，分別向其中一個(gè)瓶參與、培育終了后，分別向其中一個(gè)瓶參與IPTG終濃度終濃度0.1mM并標(biāo)志為并標(biāo)志為“+I，另一瓶不加，另一瓶不加IPTG標(biāo)志為標(biāo)志為“-I，28 培育，培育，250rpm，約，約4小時(shí)后搜集菌體；小時(shí)后搜集菌體；4、從、從“+I 、“-I培育瓶中各汲取培育瓶中各汲取1ml菌液于兩個(gè)標(biāo)有菌液于兩個(gè)標(biāo)有“+I 、“-I 的的1.5ml離心管中離心管中,離心搜集菌體離心搜集菌體,10000 rpm、RT、1分鐘，去上清，參與分鐘，去上清，參與80ul緩沖

7、液和緩沖液和40ul 3SDS上樣緩沖液懸上樣緩沖液懸浮菌體，浮菌體，-20保管備用。保管備用。1、挑取、挑取1個(gè)正確表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)化子接種于裝有個(gè)正確表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)化子接種于裝有2ml LB/KanKan濃度濃度50ug/ml培育基的培育基的PA瓶中，瓶中，37oC培育過夜；培育過夜；2、按、按1%接種量接種于接種量接種于50ml LB/Kan Kan濃度濃度50ug/ml中中37 培育約培育約2小時(shí)小時(shí)40分鐘，分鐘，OD600=0.4-0.6；前兩步與操作；前兩步與操作步驟步驟1一樣一樣3、培育終了后，向三角瓶中參與、培育終了后，向三角瓶中參與IPTG100mM50l，使培，使培育液

8、中育液中IPTG終濃度為終濃度為0.1mM；28 誘導(dǎo)培育，誘導(dǎo)培育，250rpm，約，約4小時(shí)后搜集菌體；小時(shí)后搜集菌體；4、吸菌液、吸菌液1ml于于1.5ml離心管中，另取離心管中，另取20ml倒入倒入50ml離心管中離心管中,離心搜集菌體離心搜集菌體,8000 rpm，4 ，5分鐘去除培育基，參與分鐘去除培育基，參與2ml 1PBS緩沖液懸浮菌體，然后分裝于緩沖液懸浮菌體，然后分裝于2個(gè)個(gè)1.5ml離心管中，離心管中，10000rpm，離心，離心2分鐘，去上清，分鐘，去上清，-20保管備用。保管備用。操作步驟操作步驟2： 大規(guī)模誘導(dǎo)大規(guī)模誘導(dǎo)-大量表達(dá)目大量表達(dá)目的蛋白的蛋白5、取前面保

9、管菌體參與、取前面保管菌體參與1SDS上樣緩沖液，沸水水上樣緩沖液，沸水水浴浴5分鐘破細(xì)胞，室溫冷卻；分鐘破細(xì)胞，室溫冷卻；6、在室溫以、在室溫以10000rpm離心離心1分鐘，取上清液分鐘，取上清液10-20ul SDS-PAGE蛋白電泳檢測。蛋白電泳檢測。附：附：SDS-PAGE膠的制備及蛋白質(zhì)電泳：膠的制備及蛋白質(zhì)電泳：12%分別膠配制分別膠配制(5ml):水水 1.6ml30%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 2 ml1.5M Tris-HCl (pH8.8) 1.3ml10% SDS 0.05ml10% 過硫酸銨過硫酸銨 0.05mlTEMED 0.002 ml分別膠配制時(shí)，過硫酸銨和分別膠配制

10、時(shí)，過硫酸銨和TEMED先不加，將制膠板跟電泳槽裝配好，先不加，將制膠板跟電泳槽裝配好，制膠板凹面朝向本人方便注膠，然后參與過硫酸銨和制膠板凹面朝向本人方便注膠，然后參與過硫酸銨和TEMED，將膠液混，將膠液混合均勻后注入制膠板中，再參與一定量水飽和正丁醇去除氣泡。放置合均勻后注入制膠板中，再參與一定量水飽和正丁醇去除氣泡。放置30分鐘，待膠完全凝固，去除正丁醇。然后配制積層膠。分鐘，待膠完全凝固，去除正丁醇。然后配制積層膠。5%積層膠配制積層膠配制(2ml):水水 1.4ml30%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 0.33 ml0.5M Tris-HCl (pH6.8) 0.25ml10% SDS 0.

11、02ml10% 過硫酸銨過硫酸銨 0.02mlTEMED 0.002 ml積層膠制造方法跟分別膠制造類似，混合均勻后注入膠板，緩慢的插入積層膠制造方法跟分別膠制造類似，混合均勻后注入膠板，緩慢的插入梳子，靜置梳子，靜置30分鐘，膠凝固后取出膠板，撕掉膠條，拔去梳子，再將膠分鐘，膠凝固后取出膠板，撕掉膠條，拔去梳子，再將膠板凹面背向本人裝好電泳槽。緩慢向內(nèi)槽倒入板凹面背向本人裝好電泳槽。緩慢向內(nèi)槽倒入Tris-甘氨酸電泳液，使其甘氨酸電泳液，使其沒過凹槽，向外槽倒入與內(nèi)槽持平的電泳液。沒過凹槽，向外槽倒入與內(nèi)槽持平的電泳液。 點(diǎn)樣：一切的樣品和蛋白點(diǎn)樣：一切的樣品和蛋白Marker點(diǎn)樣前都要沸水

12、浴點(diǎn)樣前都要沸水浴5分鐘使分鐘使蛋白質(zhì)完全變性。普通的點(diǎn)樣量為蛋白質(zhì)完全變性。普通的點(diǎn)樣量為10-20ul。 點(diǎn)樣終了后即可開場電泳，先以點(diǎn)樣終了后即可開場電泳，先以80伏電壓跑伏電壓跑15-20分鐘，蛋分鐘，蛋白質(zhì)經(jīng)過積層膠后，改換到白質(zhì)經(jīng)過積層膠后，改換到120伏，待溴酚藍(lán)接近分別膠底伏，待溴酚藍(lán)接近分別膠底部后停頓電泳，取下膠板，小心撬開膠板割取分別膠，放入部后停頓電泳，取下膠板，小心撬開膠板割取分別膠，放入染色皿中，參與一定染色液沒過膠面即可。置于搖床上染色皿中，參與一定染色液沒過膠面即可。置于搖床上染色染色30-45分鐘。分鐘。 染色終了后，回收染色液，參與脫色液，搖床脫色數(shù)次，前染

13、色終了后，回收染色液，參與脫色液，搖床脫色數(shù)次，前面幾次可以時(shí)間較短，第一次約面幾次可以時(shí)間較短，第一次約10分鐘，依次時(shí)間略微延伸，分鐘，依次時(shí)間略微延伸，最后一次可以過夜脫色。最后一次可以過夜脫色。實(shí)驗(yàn)二：大腸桿菌細(xì)胞破碎及蛋實(shí)驗(yàn)二：大腸桿菌細(xì)胞破碎及蛋白濃度測定白濃度測定1、取出保管的誘導(dǎo)后的細(xì)胞、取出保管的誘導(dǎo)后的細(xì)胞10ml，在冰上緩慢融化后，在冰上緩慢融化后，參與參與1mlPBS緩沖液；緩沖液；2、置冰上用超聲波破碎細(xì)胞，將超聲波發(fā)射探頭插入菌液、置冰上用超聲波破碎細(xì)胞，將超聲波發(fā)射探頭插入菌液中，開場超聲，中，開場超聲，10 sec/次，間歇次，間歇15 sec防止過度產(chǎn)熱，防止

14、過度產(chǎn)熱，反復(fù)數(shù)次普通反復(fù)數(shù)次普通5-6次直至溶液變清亮；一切過程均需在次直至溶液變清亮；一切過程均需在冰上進(jìn)展；冰上進(jìn)展；3、在、在4、13000rpm離心離心20分鐘，可溶性蛋白存在于上清分鐘，可溶性蛋白存在于上清液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；4、取上清液于另一干凈的、取上清液于另一干凈的1.5ml離心管中，取離心管中，取40l上清液測上清液測定總蛋白的濃度。定總蛋白的濃度。 采用采用BSA法測定蛋白濃度法測定蛋白濃度Bradford, 1972，首先，首先作好規(guī)范曲線，然后將樣品測得的作好規(guī)范曲線，然后將樣品測得的OD在規(guī)范曲線上比較后在規(guī)范曲線上比較后獲得

15、樣品蛋白質(zhì)濃度。獲得樣品蛋白質(zhì)濃度。 方法：方法：1、完全溶解、完全溶解BSA蛋白規(guī)范品蛋白規(guī)范品(5mg/ml)，用，用PBS將規(guī)范品稀釋將規(guī)范品稀釋成成100-500 g/ml的溶液的溶液2、分別取、分別取20L的不同濃度的的不同濃度的BSA蛋白規(guī)范品溶液參與到蛋白規(guī)范品溶液參與到1mL考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250試劑中，搖勻，室溫反響試劑中，搖勻，室溫反響5 min后，在后，在595 nm處測定光吸收值。處測定光吸收值。3、以光吸收值為縱坐標(biāo)，規(guī)范蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制規(guī)、以光吸收值為縱坐標(biāo)，規(guī)范蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制規(guī)范曲線。范曲線。 蛋白濃度規(guī)范曲線的繪制蛋白濃度規(guī)范曲線的繪制 1、

16、取出保管的誘導(dǎo)后的細(xì)胞、取出保管的誘導(dǎo)后的細(xì)胞10ml，在冰上緩慢融化后，在冰上緩慢融化后，參與參與1mlPBS緩沖液；緩沖液；2、置冰上用超聲波破碎細(xì)胞，將超聲波發(fā)射探頭插入菌液、置冰上用超聲波破碎細(xì)胞，將超聲波發(fā)射探頭插入菌液中，開場超聲，中，開場超聲，10 sec/次，間歇次，間歇15 sec防止過度產(chǎn)熱，防止過度產(chǎn)熱，反復(fù)數(shù)次普通反復(fù)數(shù)次普通5-6次直至溶液變清亮；一切過程均需在冰次直至溶液變清亮；一切過程均需在冰上進(jìn)展；上進(jìn)展；3、在、在4、13000rpm離心離心20分鐘，可溶性蛋白存在于上清分鐘，可溶性蛋白存在于上清液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；實(shí)驗(yàn)

17、三：表達(dá)蛋白的純化實(shí)驗(yàn)三：表達(dá)蛋白的純化4、細(xì)胞破碎上清液中，參與、細(xì)胞破碎上清液中，參與Ni-NTA樹脂柱，在樹脂柱，在4下結(jié)合下結(jié)合1h(離心管平放在冰盒中，每離心管平放在冰盒中，每5分鐘搖動(dòng)一次防止柱子分鐘搖動(dòng)一次防止柱子堆積在底部堆積在底部)；然后；然后5000 r/min離心離心1 min移除上清液；移除上清液；5、4條件下條件下50 mmol/L pH7.5磷酸緩沖液磷酸緩沖液1ml(1XPBS buffer)5min/次洗四次，參與次洗四次，參與40 mmol/L咪唑咪唑 (imidazole)1xPBS緩沖液洗脫緩沖液洗脫10min除雜蛋白除雜蛋白 ，離心棄上，離心棄上清；保管

18、清；保管Ni-NTA柱；柱；6、參與、參與500l 100 mmol/L咪唑咪唑 (imidazole)、 50 mmol/L pH7.5磷酸緩沖液磷酸緩沖液(1XPBS buffer)洗脫液，在洗脫液，在4條件下洗條件下洗滌滌30min后后5000 r/min離心離心1 min，用移液器小心搜集上清，用移液器小心搜集上清應(yīng)盡量防止吸到離心管底部的應(yīng)盡量防止吸到離心管底部的Ni-NTA柱，置于新的柱，置于新的1.5ml離心管中離心管中(另外取出另外取出40l樣品，測濃度，樣品，測濃度，-20儲(chǔ)存儲(chǔ)存?zhèn)溆?。備用?實(shí)驗(yàn)四：表達(dá)蛋白的鑒定實(shí)驗(yàn)四：表達(dá)蛋白的鑒定-western雜交雜交操作步驟操作步

19、驟1 蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)電泳 取取-20保管的純化好的蛋白樣品洗脫搜保管的純化好的蛋白樣品洗脫搜集的上清集的上清50l，用，用1xPBS十到五十倍稀十到五十倍稀釋；取釋；取50l稀釋液，參與稀釋液，參與25l 3SDS上樣上樣緩沖液，沸水水浴緩沖液，沸水水浴5分鐘；分鐘； 各樣品在室溫以各樣品在室溫以10000rpm離心離心1分鐘，取分鐘，取上清上清10-20ul SDS-PAGE蛋白電泳。蛋白電泳。操作步驟操作步驟2 2 蛋白質(zhì)的半干式電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的半干式電轉(zhuǎn)移戴手套操作戴手套操作將蛋白膠的積層膠切除將蛋白膠的積層膠切除(當(dāng)膠上的樣品較少當(dāng)膠上的樣品較少時(shí)，不含目的蛋白的膠應(yīng)都切除，使剩時(shí)，不

20、含目的蛋白的膠應(yīng)都切除，使剩下的膠塊盡能夠小下的膠塊盡能夠小)，然后浸入，然后浸入Towbin buffer中平衡；中平衡；預(yù)先預(yù)備公用的濾片預(yù)先預(yù)備公用的濾片2張張(或或18張濾紙張濾紙)和和1張張硝酸纖維素濾膜，其大小都應(yīng)與凝膠大硝酸纖維素濾膜，其大小都應(yīng)與凝膠大小吻合；用鉛筆在濾膜一角做好標(biāo)志；小吻合；用鉛筆在濾膜一角做好標(biāo)志；將將 1張濾片張濾片(或或9張濾紙張濾紙)在在Towbin buffer中中浸潤后放置在電極上浸潤后放置在電極上(如用如用9張濾紙那么張濾紙那么應(yīng)逐張疊放整齊應(yīng)逐張疊放整齊) ，用玻璃棒擠出一切氣，用玻璃棒擠出一切氣泡。詳細(xì)擺放順序見以下圖泡。詳細(xì)擺放順序見以下圖

21、 于于Towbin buffer中浸潤硝酸纖維素濾膜，然后置于濾紙中浸潤硝酸纖維素濾膜，然后置于濾紙/片片上，排出氣泡；上，排出氣泡； 然后將平衡好的蛋白膠置于硝酸纖維素濾膜上，排出氣泡；然后將平衡好的蛋白膠置于硝酸纖維素濾膜上，排出氣泡； 再依次將另外再依次將另外9張濾紙張濾紙(1張濾片張濾片)在在Towbin buffer中浸潤后放中浸潤后放置在蛋白膠上。置在蛋白膠上。 加上陰極電板，加上陰極電板，25V電壓轉(zhuǎn)移電壓轉(zhuǎn)移40分鐘。分鐘。 轉(zhuǎn)移完成后，取出轉(zhuǎn)移完成后，取出NC膜，在膜，在TBS漂洗漂洗5min，置入麗春紅染，置入麗春紅染液中染色，出現(xiàn)蛋白條帶后，用自來水漂洗液中染色，出現(xiàn)蛋白

22、條帶后，用自來水漂洗1min，用鉛筆標(biāo)，用鉛筆標(biāo)志處蛋白質(zhì)志處蛋白質(zhì)Marker的位置，然后參與的位置，然后參與TBS漂洗至顏色消逝；漂洗至顏色消逝； 9層濾紙電轉(zhuǎn)緩沖液層濾紙電轉(zhuǎn)緩沖液9層濾紙電轉(zhuǎn)緩沖液層濾紙電轉(zhuǎn)緩沖液陽極陽極(+)(+)陰極陰極(-)(-)Trans-Blot SD with Gel Sandwich 操作步驟操作步驟3 3 膜的封鎖膜的封鎖 用含有用含有5脫脂牛奶的脫脂牛奶的TBS-T封鎖封鎖NC膜含有膜含有0.1%吐溫吐溫20的的1倍的倍的TBS，在室溫條件下孵，在室溫條件下孵育育1至至2小時(shí)小時(shí)(引薦在引薦在4條件下孵育過夜條件下孵育過夜)； 用用TBS-T漂洗：漂洗

23、：15分鐘，分鐘，1次；次；5分鐘，分鐘，2次。次。 在室溫條件下，將在室溫條件下，將NC膜轉(zhuǎn)入含有膜轉(zhuǎn)入含有1脫脂牛奶脫脂牛奶和適宜稀釋度和適宜稀釋度1:1500的一抗的的一抗的TBS-T溶溶液中，孵育液中，孵育1至至2小時(shí)；小時(shí)； 用用TBS-T漂洗：漂洗：15分鐘，分鐘，1次；次；5分鐘，分鐘，3次。次。 操作步驟操作步驟4 一抗雜交一抗雜交操作步驟操作步驟5 5 二抗進(jìn)展雜交二抗進(jìn)展雜交 在室溫條件下，將在室溫條件下，將NC膜轉(zhuǎn)入含有膜轉(zhuǎn)入含有1脫脂脫脂牛奶和適宜稀釋度的二抗的牛奶和適宜稀釋度的二抗的TBS-T溶液中溶液中(1:5000)，孵育，孵育1小時(shí)；小時(shí)； 用用TBS-T漂洗：

24、漂洗：15分鐘，分鐘，1次；次；5分鐘，分鐘，3次。次。 用用TBS漂洗：漂洗：5分鐘，分鐘，3次次操作步驟操作步驟6 DAB3, 3二氨基聯(lián)苯二胺顯色檢二氨基聯(lián)苯二胺顯色檢測測用用DBA顯色顯色 KIT20X顯色操作步驟：顯色操作步驟：將將50ul50ul濃縮液濃縮液A A一滴稀釋于一滴稀釋于1ml PH7.01ml PH7.0蒸餾水中蒸餾水中搖勻。搖勻。再向其中參與再向其中參與B B液液 DABDAB溶液和溶液和C C液濃縮過氧化液濃縮過氧化氫溶液各一滴，再次混勻，此液需現(xiàn)用現(xiàn)配，配氫溶液各一滴，再次混勻，此液需現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后避光保管，好后避光保管，30min30min內(nèi)運(yùn)用。內(nèi)運(yùn)用。將

25、洗脫好的硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到一塊剪好的保鮮膜將洗脫好的硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到一塊剪好的保鮮膜上，然后將配好的顯色液用移液器淋到硝酸纖維素膜上，然后將配好的顯色液用移液器淋到硝酸纖維素膜上正面，室溫上正面，室溫1min1min內(nèi)將在目的條帶處看到棕紅色內(nèi)將在目的條帶處看到棕紅色條帶。條帶。Towbin Buffer： 25mM Tris pH8.3 192mM glycine 20% methanol 10TBS緩沖溶液緩沖溶液1L Tris-Base 24.2g ， NaCl 80g ，pH7.6緩沖液配方：緩沖液配方：第一組，第二組，第三組第一組，第二組，第三組 配配YPD液體培育基液體培育基1.

26、5L 葡萄糖葡萄糖 20g，酵母提取物，酵母提取物 10 g，蛋白胨，蛋白胨(Peptone)20g， pH6.5定容至定容至1L。 分裝分裝 20ml/250ml三角瓶，三角瓶，70瓶瓶第四組，第五組，第六組，第七組第四組，第五組，第六組，第七組 配配BMMY液體培育基液體培育基3L 酵母提取物酵母提取物 10 g，蛋白胨，蛋白胨(Peptone)20g ，酵母氮堿，酵母氮堿3.4g， 硫酸銨硫酸銨 10g，用，用pH7.0的的0.1M的磷酸鉀緩沖液定容至的磷酸鉀緩沖液定容至1L。 pH7.0 0.1mol/L磷酸鉀緩沖液：磷酸鉀緩沖液：1mol/L K2HPO4 61.5ml， 1mol/L KH2PO4 38.5ml，定容至，定容至1L，調(diào)理，調(diào)理pH，定容