高效液相色譜分類及工作原理教案資料

1、高效液相色譜分類及工作原理 高壓液相色譜對于揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分高壓液相色譜對于揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大的高分子化合物以及離子型化合物的分子量大的高分子化合物以及離子型化合物的分離尤為有利。如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、生物離尤為有利。如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、生物堿、核酸、甾體、類脂、維生素、抗菌素等均堿、核酸、甾體、類脂、維生素、抗菌素等均可進行分離分析定量?？蛇M行分離分析定量。第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜法概述高效液相色譜法概述一、理論基礎(chǔ)：一、理論基礎(chǔ)：速率理論速率理論CuuBAHA為渦流擴散項B/u分子擴散項Cu項即傳質(zhì)阻力項二、二、HPLC技術(shù)技術(shù)三、三、HPLC特點特點 高壓、高

2、速、高效、高靈敏度、樣品回高壓、高速、高效、高靈敏度、樣品回收方便。收方便。經(jīng)典經(jīng)典LC與與HPLC比較比較與氣相色譜法比較，與氣相色譜法比較，HPLC的優(yōu)點的優(yōu)點分析對象廣分析對象廣氣相色譜只限于分析氣體和沸點較低的化氣相色譜只限于分析氣體和沸點較低的化合物；合物；HPLC不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，適用于高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩的限制，適用于高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)。原則上講，幾乎可以分爾質(zhì)量大的物質(zhì)。原則上講，幾乎可以分析除永久氣體外所有的有機和無機化合物。析除永久氣體外所有的有機和無機化合物。流動相對分離起作用流動相對分離起作用氣相色譜的流動相僅起

3、運載作用，對氣相色譜的流動相僅起運載作用，對組分不產(chǎn)生相互作用力；組分不產(chǎn)生相互作用力；HPLC的流動相對的流動相對組分產(chǎn)生相互作用力，相當于增加了一個組分產(chǎn)生相互作用力，相當于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)。控制和改進分離條件的參數(shù)。經(jīng)常在室溫條件下操作經(jīng)常在室溫條件下操作氣相色譜法一般在較高溫度下進行氣相色譜法一般在較高溫度下進行缺點缺點：儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴格。儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴格。第二節(jié)第二節(jié) HPLC的主要類型的主要類型一、一、液一液分配色譜法（液一液分配色譜法（LLPC） 在液在液-液色譜中液色譜中,流動相和固定相都是流動相和固定相都是液體液體,它能適用于各種樣品類型

4、的分離和分它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。 1分離原理分離原理 液液分配色譜的分離原理基本與液液液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進中進行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離

5、行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。 2.固定相固定相 液液色譜的固定相由載體和固定液液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類：組成。常用的載體有下列幾類：（1）全多孔型載體：由硅膠、硅藻土等全多孔型載體：由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑約材料制成，直徑約100 m的全多孔型顆的全多孔型顆粒。粒。 這類固定相由于顆粒很細，孔仍然這類固定相由于顆粒很細，孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。（2）表面多孔型載體（薄殼

6、型微珠載表面多孔型載體（薄殼型微珠載體）：由直徑為體）：由直徑為30 40 m的實心玻璃球的實心玻璃球和厚度約為和厚度約為1 2 m的多孔性外層所組成。的多孔性外層所組成。目前，這種載體粒度為目前，這種載體粒度為5 10 m。 這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。最大允許量受限制。化學鍵合固定相化學鍵合固

7、定相：它是將各種不同有機基它是將各種不同有機基團通過化學反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。團通過化學反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。 它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產(chǎn)它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。 據(jù)統(tǒng)計，約有據(jù)統(tǒng)計，約有3/43/4以上的分離問題是在化學以上的分離問題是在化學鍵合固定相上進行的。鍵合固定相上進行的。3流動相流動相 根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程根據(jù)所

8、使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為度，將其分為正相分配色譜正相分配色譜和和反相分配色譜反相分配色譜。 正相分配色譜：正相分配色譜：流動相的極性小于固定相的極性流動相的極性小于固定相的極性， 它適用于極性化合物的分離。其它適用于極性化合物的分離。其 流出順序流出順序是極性小的先流出，極是極性小的先流出，極 性大的后流出性大的后流出。反相分配色譜：反相分配色譜：流動相的極性大于固定相的極性流動相的極性大于固定相的極性， 它適用于非極性化合物的分離，它適用于非極性化合物的分離， 其其流出順序與正相色譜恰好相反流出順序與正相色譜恰好相反二、液一固吸附色譜法二、液一固吸附色譜法(LSAC)(LSA

9、C) 液一固吸附色譜是以固體吸附劑作液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。吸附作用不同來進行分離的。1分離原理分離原理 當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定

10、程度的保留就要取代數(shù)目相當?shù)囊压潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓钟茫┯谑?，在固定相表面被吸附的流動相溶劑分用）于是，在固定相表面發(fā)生競爭吸附發(fā)生競爭吸附: X + nSad = Xad + nS達平衡時達平衡時,有有 nadnadadSXSXK其中其中Kad為吸附平衡常數(shù)為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑，值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。上保留強，難于洗脫。Kad值小值小,則保留值弱，易則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。2固定相固定相 液固吸附色譜

11、所用固定相多是一些液固吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學反應(yīng)等，因此，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。以硅膠用得最多。 目前最廣泛使用的還是目前最廣泛使用的還是5 510 10 m的的全全多孔型微粒填料。多孔型微粒填料。3.流動相流動相 一般把吸附色譜中一般把吸附色譜中流動相流動相稱作稱作洗脫劑。洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極在吸附色

12、譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。弱的洗脫劑。三、離子交換色譜法（三、離子交換色譜法（IEC） 此法是利用此法是利用離子交換原理和液相色譜技離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白于有機物的分離，

13、例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。1離子交換原理離子交換原理 離子交換色譜法是利用不同待測離子對離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如平衡離子進行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：下：陽離子交換：陽離子交換

14、：RSO3-H+M+RSO3-M+ H+陰離子交換：RNR3+Cl-+X-RNR3+X-+ Cl-一般形式： R一AB RBA達平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)達平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：的選擇系數(shù)）：rrABABABK/式中式中Ar，Br 分別代表樹脂相中洗脫劑離子分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（）和試樣離子（B）的濃度，）的濃度，A、B則代表則代表它們在溶液中的濃度。它們在溶液中的濃度。 KB/A越大，說明越大，說明B離子交換能力越大，越易保離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水離子電荷

15、越大，水合離子半徑越小，合離子半徑越小， KB/A值就越大值就越大。2.固定相固定相（l l）多孔型離子交換樹脂）多孔型離子交換樹脂 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為聚合物，直徑約為5 520m20m，有微孔型和大，有微孔型和大孔型之分?？仔椭?。（2）薄膜型離子交換樹脂 它是在直徑約對30m的固體惰性核上，凝聚12m厚的樹脂層。（3）表面多孔型離子交換樹脂 它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。（4）離子交換鍵合固定相）離子交換鍵合固定相 它是用化學反應(yīng)將離子交換基團鍵合它是用化學反應(yīng)將離子交換基團鍵合到惰

16、性載體表面。它也分為兩種類型。到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速分離。速分離。 3.流動相流動相 離子交換色譜法所用流動相大都是離子交換色譜法所用流動相大都是一定一定pH和鹽濃度和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流

17、動相中鹽離子的種類、濃度和過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值值可控制可控制k值，改變選擇性。值，改變選擇性。 有時也使用有機溶劑如甲醇或乙醇同有時也使用有機溶劑如甲醇或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提高特殊的選擇水緩沖溶液混合使用，以提高特殊的選擇性，并改善樣品的溶解度。性，并改善樣品的溶解度。鹽離子的濃度影響：鹽離子的濃度影響： 如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。上的保留值。 要視不同情況而定。例如，分離有機酸要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離

18、解程度可通過改和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的變流動相的pH值來控制。增大值來控制。增大pH值會使酸的值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。離度增大，就會使樣品的保留增大。pH值的影響：四、離子對色譜法（四、離子對色譜法（IPC） 離子對色譜法是分離分析強極性有機酸離子對色譜法是分離分析強極性有機酸和有機堿的極好方法。和有機堿的極好方法。 離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反

19、的離子（稱對離子或反離子）質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。的一種色譜法。 由于離子對化合物由于離子對化合物A-B+具有疏水性，具有疏水性，因而被非極性固定相（有機相）提取。組因而被非極性固定相（有機相）提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對流水對的能力大小不同以及形成的離子對流水性質(zhì)不同，導致各組分離子在固定相中滯性質(zhì)不同，導致各組分離子在固定相中滯

20、留時間不同，因而出峰先后不同。這就是留時間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對色譜法分離的基本原理。離子對色譜法分離的基本原理。流動相：流動相：加有平衡離子（反離子）的極性加有平衡離子（反離子）的極性 溶液通過改變流動相的溶液通過改變流動相的pH、平、平 衡離子的濃度和種類可改變分離衡離子的濃度和種類可改變分離 的選擇性。的選擇性。 固定相：固定相：非極性的疏水鍵合相非極性的疏水鍵合相五、離子色譜法（五、離子色譜法（IC）抑制型：抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型抑制柱型、連續(xù)抑制型 分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在 0.010.010.050.05毫摩爾毫摩

21、爾/ /克干樹脂克干樹脂非抑制型非抑制型: : 當進一步降低分離柱中樹脂的交換容量(0.0070.07毫摩爾/克干樹脂),使用低濃度、低電離度的有機弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測器可直接與分離柱相連，不需抑制柱。 離子色譜連續(xù)抑制裝置圖：離子色譜連續(xù)抑制裝置圖： 通過通過分離柱分離柱后的樣品再經(jīng)過后的樣品再經(jīng)過抑制柱抑制柱，使具有，使具有高背景電導的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導的流動相，高背景電導的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導的流動相，從而用電導檢測器可直接檢測各種離子的含量。從而用電導檢測器可直接檢測各種離子的含量。 若樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制若樣品為陽離子，用無機酸作流動

22、相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經(jīng)陽柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離往后，隨流動相進入抑制柱，離子交換劑的分離往后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應(yīng)：在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應(yīng)：R R+ +OHOHH H+ +ClCl- - -R-R+ +ClCl十十H H2 2O OR R+ +一一OHOH- -M M+ +ClCl- -M M+ +OHOHR R+ +ClCl- - 由反應(yīng)可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼Ш苄〉乃?，消除了流動相本底電導的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的濃度為Cl-離子的26倍，提高

23、了所測陽離子電導的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。離子色譜的應(yīng)用：離子色譜的應(yīng)用：陰離子分析陰離子分析: : 雙柱：薄殼型陰離子交換樹脂分離柱雙柱：薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3250mm),流動相：流動相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量，流量138 mL/hr。七種陰離子在七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在分含量在350 ppm。 六、空間排阻色譜法（六、空間排阻色譜法（SEC） 主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它

24、不具有吸附、分配和離子交換方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。來實現(xiàn)分離的。 1.固定相固定相 排阻色譜固定相種類很多，一般可分為排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。軟性、半剛性和剛性凝膠三類。 所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。（1）軟性凝膠）軟性凝膠 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都如葡聚糖凝膠、

25、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量小分子質(zhì)量物質(zhì)的分物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。析，不適宜用在高效液相色譜中。（2）半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。（3）剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速1cm3s-1；否則將影響凝