透明質(zhì)酸的萃取與分析

1、透明質(zhì)酸的萃取與分析透明質(zhì)酸的萃取與分析Assay and Extraction of Hyaluronic acidAssay and Extraction of Hyaluronic acid 大華技術(shù)學(xué)院化工與材料系大華技術(shù)學(xué)院化工與材料系Ta Hwa Institute of TechnologyTa Hwa Institute of TechnologyDepartment of Chemical EngineeringDepartment of Chemical Engineering 專題生專題生: :中華民國中華民國9999年年0101月月1818日日壹壹. .前言：前言： 透

2、明質(zhì)酸(Hyaluronic acid 或 Hyaluronan)以雙醣為重覆單元的生物高分子，屬於一種糖甘胺基聚醣(Glycosaminoglycan, GAG)，存在於脊椎動(dòng)物體內(nèi)幾乎所有的組織。最早是由牛的水晶體中純化出來，其水溶液為黏彈性流體，充滿在細(xì)胞間質(zhì)與結(jié)締組織間，且覆蓋在某些表皮組織上。具有吸震、保護(hù)及潤滑細(xì)胞等功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞在此黏彈性基質(zhì)上的移動(dòng)，穩(wěn)定膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及保護(hù)它免於受到機(jī)械性的破壞。 貳.來源: 透明質(zhì)酸(HA)的來源，大多存在於牛眼睛水晶體、新生兒臍帶、關(guān)節(jié)液，也在皮膚、大動(dòng)脈、腱、心臟瓣膜、鯊魚皮、鯨魚的軟骨、人類的血清、雞冠中的黏液等等。( (圖一圖一) )透

3、明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)D-glucuronic acidD-N-acetylglucosamine1,3-glycosidic bond HAHA中同時(shí)亦具有中同時(shí)亦具有高親水性區(qū)域高親水性區(qū)域，因此，因此HAHA屬於兩性分屬於兩性分子，而疏水性區(qū)域?qū)Ψ肿釉谒芤涵h(huán)境中影響頗大，因?yàn)樽?，而疏水性區(qū)域?qū)Ψ肿釉谒芤涵h(huán)境中影響頗大，因?yàn)樵谒芤褐?，在水溶液中，HAHA分子本身依靠分子本身依靠疏水性區(qū)域疏水性區(qū)域聚集在一起，減聚集在一起，減少與溶劑的接觸面積，此類特性稱為少與溶劑的接觸面積，此類特性稱為疏水性鍵結(jié)疏水性鍵結(jié)。在大部。在大部份情況下，份情況下，HAHA會(huì)以特定的方式與其他的間質(zhì)巨大

4、分子相互會(huì)以特定的方式與其他的間質(zhì)巨大分子相互作用。作用。 ( (圖圖2 2 在不同流體流動(dòng)狀態(tài)下，在不同流體流動(dòng)狀態(tài)下，HAHA表現(xiàn)出不同的性質(zhì)表現(xiàn)出不同的性質(zhì)) )來源組織來源組織濃度，濃度，mg/Lmg/L雞冠雞冠75007500新生兒臍帶新生兒臍帶41004100人的關(guān)節(jié)液人的關(guān)節(jié)液1420360014203600牛鼻的軟骨牛鼻的軟骨12001200人類的表皮人類的表皮601601人類的真皮人類的真皮508508人的眼球玻璃體人的眼球玻璃體140338140338兔腦兔腦6565兔子的肌肉兔子的肌肉2727人類胸部的淋巴液人類胸部的淋巴液8.5188.518人類的尿液人類的尿液0.10

5、.50.10.5人類的血清人類的血清0.010.10.010.1表表1 1 組織及組織液之透明質(zhì)酸濃度組織及組織液之透明質(zhì)酸濃度 參參.HA.HA的應(yīng)用的應(yīng)用 (1).(1).治療關(guān)節(jié)炎治療關(guān)節(jié)炎 (2).(2).眼科手術(shù)眼科手術(shù) (3).(3).外科手術(shù)外科手術(shù) (4).(4).可做為診斷肝疾病的指標(biāo)可做為診斷肝疾病的指標(biāo) (5).(5).化妝品化妝品圖圖3 HA3 HA與膠原蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交互作用。與膠原蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交互作用。PG-PG-蛋白醣，蛋白醣，HA-HA-透明質(zhì)透明質(zhì) 酸，酸，Collagen-Collagen-膠原蛋白。膠原蛋白。 肆、具體內(nèi)容及配合措施肆、具體內(nèi)容及配合措施一、

6、一、HAHA的分離及純化方法的分離及純化方法 1 1、動(dòng)物組織之透明質(zhì)酸的分離及純化技術(shù)、動(dòng)物組織之透明質(zhì)酸的分離及純化技術(shù) 2 2、可分兩種方法、可分兩種方法: : (1). (1).化妝品級(jí)之純化?；瘖y品級(jí)之純化。 (2).(2).醫(yī)藥級(jí)之純化醫(yī)藥級(jí)之純化 。二、透明質(zhì)酸之分析二、透明質(zhì)酸之分析 1.1.透明質(zhì)酸之鑑定分析透明質(zhì)酸之鑑定分析 2.2.透明質(zhì)酸之電泳分析透明質(zhì)酸之電泳分析 3.3.透明質(zhì)酸分子量之量測透明質(zhì)酸分子量之量測 4.4.透明質(zhì)酸之純度分析透明質(zhì)酸之純度分析 1.1.透明質(zhì)酸之鑑定分析透明質(zhì)酸之鑑定分析 - - 還原力的測定還原力的測定 (1)(1)、試劑：、試劑：6

7、0% (W/V) 60% (W/V) 酒石酸鉀鈉溶液酒石酸鉀鈉溶液 DNS solutionDNS solution：0.96% DNS (3,5-Dinitrosalicylic 0.96% DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid) acid)，3.07% Sodium Hydroxide3.07% Sodium Hydroxide。 取等量體積的酒石酸鉀鈉溶液與取等量體積的酒石酸鉀鈉溶液與DNSDNS溶液混勻即可（需溶液混勻即可（需 避光），簡稱避光），簡稱DNSDNS試劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖所示。試劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖所示。伍、實(shí)驗(yàn)設(shè)備伍、實(shí)驗(yàn)設(shè)備: : 1. 1.高

8、速冷凍離心機(jī)高速冷凍離心機(jī) 2.2.真空冷凍濃縮乾燥機(jī)真空冷凍濃縮乾燥機(jī) 3.3.分光光譜儀分光光譜儀 4.4.超低溫冷凍櫃超低溫冷凍櫃 5.5.加熱攪拌器加熱攪拌器 6.6.試管震盪器試管震盪器陸、實(shí)驗(yàn)步驟陸、實(shí)驗(yàn)步驟 : :( (一一) )、動(dòng)物組織之透明質(zhì)酸的分離及純化技術(shù)、動(dòng)物組織之透明質(zhì)酸的分離及純化技術(shù) (1).動(dòng)物組織雞冠攪碎萃取液150ml溶於150ml水中，攪拌 (2).加入2.05g 醋酸鈉及加入5g鳳梨酵素或木瓜酵素 (3).調(diào) pH 值至 4.6 (用HCl 溶液)攪拌24hr (4).離心取上層液體, 上層液體濃縮至一半，約150ml (5).取50ml上層濃縮液(另

9、外100ml儲(chǔ)放冰箱)，加入5g trichloroacetic acid，攪拌12hr，離心，取上層液 (6).上層液加入75ml(乙醇:醋酸鈉=4:1)，攪拌12hr，離心，取 固體沈澱物為產(chǎn)物 (7).沈澱物加入酒精洗，濃縮，抽乾23次( (二二) )、化妝品級(jí)之純化步驟：、化妝品級(jí)之純化步驟： (1).雞冠液75ml溶於水75ml加入木瓜酵素2.5g將pH 值調(diào)為5(用 HCl 溶液)，攪拌一天。 (2).先冷凍離心保留液體並加熱至90、20分鐘。 (3).加入四倍體積的3% 醋酸鈉(600ml)，將pH 值調(diào)為7，攪拌一 天。 (4) .先冷凍離心保留液體，加入一倍體積的異丙醇(15

10、0ml)使之 沈澱再溶於3%醋酸鈉，並以異丙醇使之沈澱，攪拌一天。 (5).冷凍離心保留固體。 (6).沈澱物加入酒精洗，濃縮，抽乾23次。( (三三) ) 、成品鑑定步驟、成品鑑定步驟 (1)精稱標(biāo)準(zhǔn)品酵素0.002g,雞冠粉末(ABCD)四種各取0.0055g 再加入1000緩衝液(50mMPi pH7.0)振盪器振盪使溶液溶 解。 (2)將酵素溶液取50加入標(biāo)準(zhǔn)品及雞冠溶液中，振盪器振盪。 (3)取標(biāo)準(zhǔn)品及雞冠溶液分別取250置於新的離心瓶中，再加 入250DNS，放置95加熱器加熱10分鐘(空白試驗(yàn)) ，其 餘放置37恆溫1小時(shí)。 (4)1小時(shí)後分別取標(biāo)準(zhǔn)品及雞冠溶液分別取250置於新

11、的離心 瓶中，同上述步驟相同，然後間隔2小時(shí)或3小時(shí)量取，直到 用完為止。 (5)最後測UV各別吸收度，波長540nm記錄如表。柒、數(shù)據(jù)結(jié)果柒、數(shù)據(jù)結(jié)果 ： 1.Hyaluronidase 1.Hyaluronidase 利用利用DNSDNS法法 ( (波長為波長為540nm)540nm)樣品樣品 樣品樣品 重重1hr1hr2hr2hr3hr3hr25hr25hr聿新聿新0.0061 0.0061 0.05551 0.05551 0.570850.570850.84680 0.84680 1.8600 1.8600 雞冠雞冠0.01180.01180.11108 0.11108 0.27185 0.27185 0.66188 0.66188 捌、討論：捌、討論： (1).(1).利用利用DNSDNS法，可得各個(gè)樣品吸收度皆有上升的趨勢。法，可得各個(gè)樣品吸收度皆有上升的趨勢。 (2).(2).表示各個(gè)樣品皆有被表示各個(gè)樣品皆有被hyaluronidasehyaluronidase分解的能力，亦分解的能力，亦