表達譜基因芯片樣品制備指南

1、表達譜基因芯片樣品制備指南一、說明 本指南的目的在于向客戶介紹用于表達譜芯片的樣品制備的一般原則以及我公司對于客戶樣品的基本要求。包括在樣品采集、制備、貯存、運輸各階段需要遵循的一般原則、注意事項等，以及我公司基于對樣品質(zhì)量和數(shù)量的要求而提供的各種類型樣品的采集、制備等方面建議流程(在滿足我公司樣品要求的范圍內(nèi),所有操作規(guī)程僅供客戶參考)。 二、樣品制備的基本原則 代表性原則：取樣的代表性直接關(guān)系到實驗結(jié)果的最后解釋。應(yīng)該根據(jù)您的實驗?zāi)康纳髦剡x擇您的取樣方案，包括樣品類型（單一或混合組織類型，單一或混合細胞類型等），取樣的操作流程，對照組的設(shè)定?；疽笫菍嶒炋幚斫M和對照組的樣品在取材方式和處

2、理條件等方面盡可能保持一致，否則可能會影響實驗結(jié)果的可信度 。 準(zhǔn)確性原則：取樣的準(zhǔn)確性直接關(guān)系到實驗結(jié)果的科學(xué)意義。所有樣品（實驗組和對照組）的取材必須快速準(zhǔn)確同時立即進行后續(xù)處理（樣品固定化或RNA提取），以減少外界因素對樣品原始特性的改變，否則最后的實驗結(jié)果將難以反映樣品的真實特性。規(guī)范性原則：實驗過程的操作包括樣品收集、貯存、運輸以及后續(xù)處理是決定芯片實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可信度的最關(guān)鍵因素。因此必須制訂和嚴(yán)格執(zhí)行規(guī)范化的操作規(guī)程?？赡苌婕暗膯栴}包括：樣品質(zhì)量問題（RNA降解或含有影響后續(xù)操作的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)，基因組DNA，鹽類）；樣品收集過程的不規(guī)范性（實驗組與對照組取樣標(biāo)準(zhǔn)的差異，取樣操

3、作設(shè)計與實驗?zāi)康牡钠睿?。三、本公司可接收的樣品類型及樣品?本公司可接收的樣品類型包括：冷凍或新鮮組織、培養(yǎng)或分離的細胞以及RNA 樣品。同時本公司還可以根據(jù)客戶的要求在公司內(nèi)部實驗室進行包括細胞培養(yǎng)，不同條件的處理以及樣品的收集工作?？蛻羧绻峁┏艘酝馄渌厥忸愋偷臉悠氛堊稍儽竟旧虅?wù)中心。 對于樣品量的要求必須根據(jù)客戶提供樣品的取材難易以及客戶要求提供的芯片服務(wù)類型而異。包括：對于取材量不受限制和不要求進行擴增的樣品，客戶需按每張芯片提供至少60g總RNA或總RNA可提取量相當(dāng)?shù)钠渌愋蜆悠?；對于取材相對較難或根據(jù)客戶實驗的要求必須進行擴增處理的樣品，客戶需按每張芯片提供至少5g的總R

4、NA或總RNA可提取量相當(dāng)?shù)钠渌愋蜆悠?；對于其他特殊情形或客戶有任何疑問請咨詢本公司商?wù)中心了解詳細情況。 由于樣品類型直接影響到其中的總RNA產(chǎn)量，對于不同的樣品所需要的原始樣品量也有差異，需要客戶自己掌握或咨詢本公司商務(wù)中心。四、本公司的樣品接收程序以及質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn) 樣品采集、包裝、運輸過程中的注意事項：1. 在包裹樣品的鋁箔或冷凍保存管表面，用油性記號筆標(biāo)明樣品編號及樣品類型。并且不要與乙醇等有機溶劑接觸。2. 不要用紗布、紙張直接包裹樣品，而是用鋁箔或冷凍保存管包裹后再裝入樣品袋中。3. 不要把標(biāo)簽紙或其他紙制的說明性文件放入樣品袋內(nèi)，因為紙張在液氮中是易碎的。4. 不要用玻璃容器在液氮

5、中保存樣品；樣品包裝中不要使用透明膠帶；5. 標(biāo)簽紙應(yīng)該貼于樣品袋繩上，不要貼于容器表面以免脫落造成樣品混亂。6. 不要在一只樣品袋中放過多的樣品，以防無法放入液氮罐或無法從液氮罐中取出。樣品袋在使用前先在液氮中預(yù)冷。7. 客戶在填寫樣品登記單時，應(yīng)當(dāng)詳細描述樣品的類型、處理方法、儲存條件以及儲存時間等相關(guān)細節(jié)，同時需要客戶自己或由客戶授權(quán)本公司協(xié)助填寫詳細的實驗設(shè)計（包括實驗組與對照組的分組方式，樣品是否需要擴增，使用的芯片類型），以便技術(shù)人員確定合理的處理方案。 樣品接收程序：1. 客戶與公司簽訂委托服務(wù)合同并付預(yù)付款后，將符合要求的樣品（附樣品登記單）直接或委托客戶工程師送至本公司商務(wù)中

6、心。2. 商務(wù)中心收到樣品后，立即登記并送技術(shù)服務(wù)平臺。3. 技術(shù)服務(wù)平臺在接收樣品時，將檢查運輸包裝中液氮、干冰等量是否足以保持樣品穩(wěn)定以及實際樣品數(shù)目與樣品登記單中的記錄樣品數(shù)目是否相符，樣品登記單填寫是否完整，實驗設(shè)計說明是否明確。4. 技術(shù)服務(wù)平臺接收樣品后，將在規(guī)定的工作日內(nèi)完成總RNA 提取而后送質(zhì)量部質(zhì)檢。質(zhì)量部質(zhì)檢后，將向商務(wù)中心出具質(zhì)檢報告。商務(wù)中心在規(guī)定的工作日內(nèi)向客戶提供質(zhì)檢報告。5. 質(zhì)檢合格的樣品，技術(shù)服務(wù)平臺在規(guī)定的工作日內(nèi)完成實驗。 樣品的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)及各種樣品的主要不合格原因：本公司在收到客戶樣品后首先需要進行質(zhì)檢，本公司的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)包括對總RNA進行定量（A260/

7、A280比值在2左右），總RNA電泳檢查（需要有清晰的18s和28s rRNA條帶，同時28s/18s的比例應(yīng)在2：1以上）?？蛻魳悠肺催_到質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)通常包括以下情形：冷凍組織樣品的RNA降解；細胞樣品的總RNA量不足或降解；客戶提供的RNA樣品降解。 五、組織樣品采集操作流程1. 首先準(zhǔn)備好用于包裝樣品的鋁箔或冷凍保存管，并且用油性記號筆在鋁箔或凍存管外表多處寫明樣品編號。2. 準(zhǔn)確切除所需組織。3. 離體新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。4. 在RNase-free 的0.9生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。5. 用準(zhǔn)備好的鋁箔或冷凍保存管裝載包裹組織，迅速投入

8、液氮冷卻。6. 把樣品袋（紗布袋等）放入液氮中冷凍一下，而后將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個樣品袋只保存同樣的組織，樣品較多時應(yīng)分裝至多個小袋，不要在一只樣品袋中放過多的樣品以防無法放入液氮罐或無法從液氮罐中取出），袋口留一根編號繩，繩上粘2 張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：客戶名、樣品名稱、編號、日期，粘2 張標(biāo)簽紙是為了防止標(biāo)簽脫落造成樣品混亂），迅速轉(zhuǎn)入液氮罐。7. 填寫樣品登記單，寫明樣品名稱、組織類型、編號、取樣日期、樣品處理過程等情況。 注意事項1. 對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤組織和正常組織，如果有可能請根據(jù)冰凍切片報告的結(jié)果來判定要進行研究的取材部位。2. 不要用 Eppen

9、dorf 管保存組織樣品 ，因為 Eppendorf 管從液氮中取出時極易發(fā)生爆裂而造成樣品損失 。3. 步驟 25應(yīng)在冰上盡可能快速進行，時間過長會導(dǎo)致樣品RNA降解 。4. 在臨床手術(shù)過程中采集的病理或正常樣品 ，如果沒有條件立即從手術(shù)室中取出進行后續(xù)處理 ，請在切除后立即轉(zhuǎn)移到液氮中保存。 六、細胞及血液樣品采集操作建議流程. 貼壁細胞1. 貼壁細胞培養(yǎng)或處理結(jié)束后，去除培養(yǎng)液；2. 按每10 cm2 培養(yǎng)面積加1 mL TRIzol 試劑的比例加入TRIzol 試劑；3. 用1 mL槍頭反復(fù)吹打, 使TRIzol接觸所有長有細胞的培養(yǎng)瓶表面進行充分消化；4. 轉(zhuǎn)移到RNase-free

10、 的試管中用一次性注射器進行反復(fù)抽打細胞直至看不見成團的細胞塊，整個溶液應(yīng)該為清亮而且不粘稠的狀態(tài)；5. 放入干冰或-80冰箱中保存。 懸浮細胞6. 懸浮細胞培養(yǎng)或處理結(jié)束后，去除培養(yǎng)液；7. 保留的細胞用PBS 緩沖液快速洗一次，離心除去PBS 緩沖液；8. 按照每5×106 個細胞加1 mL TRIzol 的比例加入TRIzol 試劑，用一次性注射器進行反復(fù)抽打細胞直至看不見成團的細胞塊，整個溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài)；9. 放入干冰或-80冰箱中保存。 血液1. 在已加入抗凝劑的新鮮全血中加入等體積PBS（1×），充分混勻；2. 緩慢轉(zhuǎn)入另一已加入淋巴細胞分離液的離心管

11、中，并使上述混合液處于淋巴細胞分離液液面之上（即兩種液體不要混合，保留清晰的界面），3000 g 離心30 min；3. 用移液槍小心分離出白細胞層；用PBS（1×）清洗白細胞，離心回收白細胞，棄去上清；4. 加入白細胞20倍體積的TRIzol 試劑，用一次性注射器進行反復(fù)抽打細胞直至看不見成團的細胞塊，整個溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài)；5. 放入干冰或-80冰箱中保存。 注意事項1. 我們不接收未經(jīng)TRIzol 試劑處理的細胞樣品以及未經(jīng)分離白細胞的全血樣品。2. 客戶如果提供凍存可復(fù)蘇的細胞株，應(yīng)首先驗證所用凍存方法用于RNA 提取的可靠性，并且在送樣時提供詳盡的復(fù)蘇方法，以便確保實

12、驗成功。3. 所有樣品均應(yīng)標(biāo)明準(zhǔn)確的樣品編號，同時配有一張樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等。七、總RNA 樣品制備操作流程1. 用于RNA 提取的試劑及其他物品必須為RNase-free 的，并且盡量在潔凈、不通風(fēng)的環(huán)境中進行實驗。2. 客戶應(yīng)當(dāng)選用自己熟悉的或公認(rèn)可以得到良好實驗結(jié)果的提取方法（如使用EasyExtract、TRIzol或RNeasy ）進行RNA 的提取。3. 可以根據(jù)實際需要選擇RNA 的保存方法：需要長期保存的RNA 樣品保存于75乙醇中；無需長期保存的RNA 樣品保存于RNase-free 的雙蒸水或Elution buffer 中。4.

13、 建議客戶送樣時提供保存于RNase-free 的雙蒸水或Elution buffer 中的RNA 樣品。樣品濃度不應(yīng)低于3g/l (需要擴增的樣品濃度不應(yīng)低于0.2g/l)。5. 建議客戶送樣時提供RNA 樣品的電泳圖譜以及相關(guān)的OD 值等實驗數(shù)據(jù)。6. RNA 樣品的保存介質(zhì)請務(wù)必在樣品登記單上加以說明。7. RNA 樣品完全干燥后很難溶于水，因此不要提供干燥狀態(tài)的RNA 樣品。8. 樣品到達公司后，技術(shù)服務(wù)平臺將在規(guī)定的工作日內(nèi)進行質(zhì)檢。9. 按RNA質(zhì)量按我公司的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)判定，即A260/A280比值應(yīng)在2左右，總RNA電泳檢查需要有清晰的18s和28s rRNA條帶，同時28s/18

14、s的比例應(yīng)在2：1以上，70°C 水浴保溫1 小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。如果經(jīng)質(zhì)檢證明RNA 樣品未達到我公司質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)時，商務(wù)中心將及時與客戶聯(lián)系，協(xié)商進一步處理事宜。 八、其他的樣品處理方法 RNAlater（以下內(nèi)容源于Qiagen公司的產(chǎn)品說明書，僅供參考）1簡介RNAlater 是一種液態(tài)的，無毒的組織保存試劑。它能迅速穩(wěn)定組織，保護非冷凍細胞RNA 于原位。獲得組織塊后，迅速浸泡在RNAlater 中保存，而不會引起RNA 的降解，這樣可以不必馬上處理樣品或?qū)悠防鋬鲈谝旱幸詡湟院筇幚?。RNAlater 應(yīng)保存在室溫下，保質(zhì)期6 個月。如放置在4條件

15、下則會引起沉淀，此時需加熱到37才可澄清。RNAlater 可廣泛應(yīng)用于多種脊椎動物樣品。包括腦、心、腎、脾、肝、睪丸、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。RNAlater 對大腸桿菌、果蠅、組織培養(yǎng)細胞、全血細胞和一些植物也有效。RNAlater 能否與RNA 提取試劑盒兼容？RNAlater 可與大多數(shù)RNA 提取方法相協(xié)調(diào)。特別是TRI Reagent., RNAwiz, TTALLY RNA,RNAqueous, and Poly(A)Pure。2. 如何使用RNAlaterRNAlater 只能用于新鮮組織，在浸入RNAlater 之前不能冷凍組織。簡單切碎組織樣品，任何一邊的最大厚度不能大于0

16、.5cm, 然后將組織碎塊放入到5 倍體積的RNAlater 中保存。 動物組織RNAlater 不會溶解或破壞組織樣品的結(jié)構(gòu)。如果需要的話，仍可將已經(jīng)平衡在RNAlater 溶液中的組織取出并分割成更小的塊再重新放入到RNAlater 中。小器官如鼠肝、腎和脾可以完整地保存在RNAlater 中。 植物組織許多植物組織可以簡單浸泡在5 倍體積的RNAlater 中保存。具有自然屏障防止擴散的植物如蠟表皮的葉組織可能需要先破壞其屏障，以允許RNAlater 進入組織。 組織培養(yǎng)細胞沉淀細胞，用PBS 洗一次，再用少量的PBS 懸浮細胞，然后加510 倍體積的RNAlater 保存。 白細胞如果

17、將白細胞從紅細胞和血清中分離出來，并按組織培養(yǎng)細胞一樣處理后，白細胞便能有效地保存在RNAlater 中。不要將全血、血漿或血清中的RNA 保存在RNAlater 中，因為它們蛋白含量過高，與RNAlater 混合后易形成不溶的沉淀。 細菌RNAlater 是抑菌的，雖然細菌在RNAlater 中不能生長，但細胞仍保持其完整性。大腸桿菌保存在RNAlater 中4條件下1 個月仍很完整，產(chǎn)生不降解的RNA。3. RNAlater 中樣品的保存 保存于-80建議用于批量保存。將樣品在4條件下孵育過夜，然后從RNAlater 溶液中取出樣品保存于-80。對于組織培養(yǎng)細胞，不必移去RNAlater，

18、只需簡單凍存整個溶液。實驗證明，細胞在-80條件下凍存于RNAlater 溶液中并未出現(xiàn)溶解。樣品可隨后在室溫下解凍及再凍存，其RNA的質(zhì)和量都不會受到影響。 保存于-20建議用于批量保存。將樣品在4條件下孵育過夜，然后轉(zhuǎn)移到-20。樣品在-20條件下不會凍結(jié)，但在存貯緩沖液中會有結(jié)晶形成，這并不影響隨后的RNA 提取。樣品可隨后在室溫下解凍及再凍存，其RNA 的質(zhì)和量都不會受到影響。 保存于4廠家認(rèn)為，目前尚無證據(jù)證明樣品存于4 1 個月內(nèi)會出現(xiàn)RNA 降解。 如果沒有冰箱：將樣品放在盡可能冷的環(huán)境中。如果周圍溫度超過25，應(yīng)盡可能使RNAlater 中的樣品冰浴數(shù)小時。4. RNAlate

19、r 中樣品的RNA 提取 組織用消毒鑷子將組織從存貯溶液RNAlater 中取出，浸泡在RNA 提取溶液中。一旦將組織放入RNA提取溶液中，勻漿一定要迅速進行。 細胞從存貯在RNAlater 中的細胞中提取RNA 有兩種操作方法可供選擇：去除RNAlater 或者從細胞與RNAlater 的混合物中直接提取RNA。5. 從RNAlater 中取出樣品 去除RNAlater因為RNAlater 的濃度比典型的細胞培養(yǎng)介質(zhì)的濃度高，因此用通常沉淀活細胞的離心力無法沉淀RNAlater 中的細胞。離心沉淀細胞，去除RNAlater。（HeLa 細胞大約需要3000×g，但其他細胞可能不能容

20、忍這個速度，或者他們需要更大的離心力。） 從RNAlater 中的細胞直接提取RNA作為選擇，我們可以用一步法破碎/提取溶液（如TRI Reagent 和RNAwiz）從沒有去除RNAlater 的細胞中純化RNA。這可通過向細胞混合物中加入10 倍體積的一步提取溶液完成，其他照常。 RNAsecure：（以下內(nèi)容源于Ambion 公司的產(chǎn)品說明書，僅供參考）1.簡介在分子生物學(xué)試劑中用的RNAsecure 代替DEPC，有很多優(yōu)點：1) 可以加入到不能用DEPC 處理的溶液中（如：Tris 或MOPS 緩沖液）；2) 可以加入到不能被高壓滅菌的溶液中；3) 可以加入到加酶之前的酶促反應(yīng)中。Ambion 已經(jīng)測試了有RNAsecure 試劑存在的如下酶促反應(yīng)（先于酶加入）：RNA 多聚酶T7，T3 和SP6 的體外轉(zhuǎn)錄（37），MMLV 和AMV逆轉(zhuǎn)錄（42），以及SuperTaq PCR（94），均沒有出現(xiàn)酶