葉綠素含量測定方法(共4頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實(shí)驗(yàn)14 葉綠素a和b含量的測定（分光光度法）一、目的 學(xué)會Chla、b含量的測定方法，了解葉片中Chla、b的含量。二、材料用具及儀器藥品菠菜葉片、721分光光度計(jì)、天平、研缽、剪刀、容量瓶（25ml）、漏斗、濾紙、乙醇（95%）三、原理葉綠素a、b在波長方面的最大吸收峰位于665nm和649nm，同時(shí)在該波長時(shí)葉綠素a、b的比吸收系數(shù)K為已知，我們即可以根據(jù)Lambert Beer定律，列出濃度C與光密度D之間的關(guān)系式：D665=83.31Ca+18.60Cb.(1)D649=24.54Ca+44.24 Cb.(2)(1)(2)式中的D665、D649為葉綠素溶液

2、在波長665nm和649nm時(shí)的光密度。為葉綠素a、b的濃度、單位為每升克數(shù)。82.04、9.27為葉綠素a、b在、在波長665nm時(shí)的比吸收系數(shù)。16.75、45.6為葉綠素a、b在、在波長649nm時(shí)的比吸收系數(shù)。解方程式(1)(2)，則得 ：CA=13.7 D6655.76 D649(3)CB=25.8 D6497.6 D665 (4)G=CA+CB=6.10 D665+20.04 D649(5)此時(shí)，G為總?cè)~綠素濃度，CA、CB為葉綠素a、b濃度，單位為每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以計(jì)算葉綠素a、b及總?cè)~綠素的總含量。四、方法步驟1稱取0.1克新鮮葉片，剪碎，放在研缽中

3、，加入乙醇10ml共研磨成勻漿，再加5ml乙醇，過濾，最后將濾液用乙醇定容到25ml。2取一光徑為1cm的比色杯，注入上述的葉綠素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同樣規(guī)格的比色杯中，作為對照，在721分光光度計(jì)下分別以665nm和649nm波長測出該色素液的光密度。計(jì)算結(jié)果：葉綠素a含量（mg/g. FW）=葉綠素b含量（mg/g.FW）=葉綠素總量（mg/g.FW）= 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 計(jì)算所測植物材料的葉綠素含量。六、思考題 測定葉綠素a、b含量為什么要選用紅光的波長？3. 2 葉綠體色素的含量測定 原理 根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長下測定其吸光度，即可用公式計(jì)

4、算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即： A CL 式中：為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。 如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。要測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個(gè)特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、

5、b時(shí)，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。 已知葉綠素a、b的80丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的吸光系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式： A66382.04Ca+9.27Cb (1) A64516.75Ca+45.60Cb (2) 式（1）、（2）中的A645和A663為葉綠素溶液在波長663 nm和645 nm時(shí)的吸光度，Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg·L-1為單位。 解方程組(1

6、)、(2)，得： Ca12.72A663-2.59A645 (3) Cb22.88A645-4.67A663 (4) 將Ca與Cb相加即得葉綠素總量CT： CT Ca+ Cb 20.29A645+8.05A663 (5) 另外，由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的吸光系數(shù)(均為34.5)，也可以在此波長下測定一次吸光度(A652)而求出葉綠素a、b總量：CTA652×1000/34.5 (6) 在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時(shí)測定出溶液中類胡蘿卜素的含量。 Lichtenthaler等對Arnon法進(jìn)行了修正，提出了80丙酮提取液中三種色素含量的計(jì)算公式：

7、 Ca12.21A663-2.81A646 (7)Cb20.13A646-5.03A663 (8) Cc (1 000A470 -3.27Ca-104Cb)/229 (9)式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cc為類胡蘿卜素的總濃度；A663、A646和A470分別為葉綠體色素提取液在波長663nm、646nm和470nm下的吸光度。 由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)，計(jì)算公式也有所不同。葉綠素a、b在95乙醇中最大吸收峰的波長分別為665nm和649nm，類胡蘿卜素為470nm，可據(jù)此列出以下關(guān)系式： Ca13.95A6656.88A649 (

8、10) Cb24.96A6497.32A665 (11) Cc (1 000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 (12)材料、儀器設(shè)備及試劑1. 材料新鮮植物葉片。 2. 儀器設(shè)備分光光度計(jì)；電子天平(感量0.01g)；研缽；棕色容量瓶；小漏斗；濾紙；吸水紙；擦鏡紙；滴管。3. 試劑 （1）95乙醇(或80丙酮)。（2）石英砂。（3）碳酸鈣粉。 方法 1取新鮮植物葉片(或其他綠色組織)或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎 (去掉中脈)，混勻。 2稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及23ml 95乙醇(或80丙酮)，研成勻漿，再加乙醇10ml，繼

9、續(xù)研磨至組織變白。靜置35min。 3取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?4用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中，直至濾紙和殘?jiān)袩o綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。 5把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95乙醇為空白，在波長665nm、649nm和470nm下測定吸光度。6. 結(jié)果計(jì)算 按公式(10)、(11)、(12)(如用80丙酮，則按公式7、8、9)分別計(jì)算葉綠素a、b和類胡蘿卜素的濃度(mg·L-1)。(10)、(11)式

10、相加即得葉綠素總濃度。 求得色素的濃度后，再按下式計(jì)算組織中單位鮮重或干重的各種色素的含量：A n·C·N·W-1（mg·g-1）A葉綠體色素的含量；C色素的濃度；n提取液體積；N稀釋倍數(shù)；W樣品鮮重。注意事項(xiàng)1為了避免葉綠素光分解，操作時(shí)應(yīng)在弱光下進(jìn)行，研磨時(shí)間應(yīng)盡量短些。 2葉綠體色素提取液不能混濁?？稍?10nm或750nm波長下測量吸光度，其值應(yīng)小于當(dāng)波長為葉綠素a吸收峰時(shí)吸光度值的5，否則應(yīng)重新過濾。 3用分光光度計(jì)法測定葉綠素含量，對分光光度計(jì)的波長精確度要求較高。如果波長與原吸收峰波長相差1nm，則葉綠素a的測定誤差為2，葉綠素b為19，使用前必須對分光光度計(jì)的波長進(jìn)行校正。校正方法除按儀器說明書外，還應(yīng)以純的葉綠素a和b來校正。4在使用低檔型號分光光度計(jì)(如722型、721型等)測定葉綠素a、b含量時(shí)，因儀器的狹縫較寬，分光性能差，單色光的純度低(57nm)，與高中檔儀器如島津UV-120、UV-240等測定結(jié)果相比，葉綠素