基因的轉(zhuǎn)移和重組

1、第三章 基因的轉(zhuǎn)移和重組 自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組是基因變異和物種進(jìn)化的基礎(chǔ)，也在繁殖、病毒感染、基因表達(dá)以及癌基因激活等過程中起重要的作用。人們正是對(duì)自然界基因轉(zhuǎn)移和重組的認(rèn)識(shí)，才發(fā)展起DNA重組技術(shù)。第一節(jié) 基因的轉(zhuǎn)移一、 細(xì)菌的接合（一）概念：細(xì)菌細(xì)胞通過相互接觸使遺傳信息從供體細(xì)胞單向轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過程。在發(fā)現(xiàn)接合以前，人們就對(duì)細(xì)菌的雜交進(jìn)行探索，但存在兩大難題不易解決。1. ab × ab 雜交后得到的重組子頻率很低，和基因回復(fù)突變的頻率相接近。難以確定ab是由于ab 或ab 親本回復(fù)突變而產(chǎn)生，還是真正的重組產(chǎn)物。2.現(xiàn)已知道細(xì)菌重組頻率低于106 ，觀察百萬個(gè)菌落以上才

2、可能出現(xiàn)一個(gè)重組菌落，對(duì)于當(dāng)時(shí)用形態(tài)特征作為研究對(duì)象來說，工作量太大。（二）實(shí)驗(yàn)證據(jù)1、1946年，萊德伯格（Lederberg）和塔特姆（Tatum）的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌雜交實(shí)驗(yàn)。2、1950年,戴維(Davis,B.D.)U型管實(shí)驗(yàn)（三）遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移1953年，海斯（Hayes，W）在重復(fù)萊德伯格和塔特姆的雜交實(shí)驗(yàn)之前，先用高劑量的鏈霉素處理A菌株，結(jié)果A菌株受處理后雜交結(jié)果不受影響，而B菌株受處理后卻完全阻止了重組的發(fā)生。這意味兩個(gè)菌株在雜交過程中的作用是不同的，可能不是交互的過程。 因?yàn)殒溍顾乜梢宰柚辜?xì)胞分裂，繼而殺死細(xì)胞，但它還可以讓雜交持續(xù)一個(gè)短時(shí)間，A菌株在雜交后被殺死，但并

3、不影響雜交結(jié)果，表明它是一種供體，像雄性動(dòng)物一樣，交配后被殺死不影響后代。而B菌株像是一種受體，和雌性動(dòng)物一樣，受孕后被殺死的話，就不會(huì)產(chǎn)生后代。海斯的結(jié)論認(rèn)為細(xì)菌在接合過程中,兩個(gè)親本在雜交中所起作用不同,有供體和受體之分,相當(dāng)于”雄性”和”雌性”（四）F因子的發(fā)現(xiàn)海斯將放入冰箱一年之久的一個(gè)菌種 A（strs ）和B（ strs ）進(jìn)行雜交，A菌株是推測(cè)的雄性，B菌株是推測(cè)的雌性，結(jié)果和預(yù)期不同，不能產(chǎn)生重組子。他將A菌種進(jìn)行誘變，使其由strs 變成strr，以便試著和另一品系A(chǔ)（ strs ）雜交，結(jié)果是可育的，說明原來的雄性A菌株放在冰箱內(nèi)一年變成了雌性，即從供體變成了受體。以上實(shí)驗(yàn)

4、完成不久，萊德博格和她的妻子也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。他們對(duì)此的一致解釋是，所謂的供體或雄性是細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)有一種致育因子（fertility factor，F(xiàn))， F表示，而雌性品系缺乏這種F因子，以F表示。 原先的F品系(A)放置冰箱一年后丟失的F因子，變成了F，作為F的A品系不能和另一F的B品系雜交，所以不育。丟失F因子的A菌株經(jīng)誘變后其基因型由strs變?yōu)閟trr ，但仍為F，作為F的A菌株可與另一品系的F的A（ strs)雜交，經(jīng)strr選擇培養(yǎng)基篩選出的重組子仍是F(strr) ，獲得的重組子和F的（ strs ）雜交仍然可育，這樣便發(fā)現(xiàn)了F因子。F因子存在的細(xì)菌為F，F(xiàn)因子喪失的細(xì)菌為F，

5、F細(xì)胞分裂后仍為F,在這一點(diǎn)上F類似于染色體基因。但F并不是染色體基因，因?yàn)槿旧w基因不那么容易消失，且染色體基因的轉(zhuǎn)移頻率不超過106，而F因子的轉(zhuǎn)移頻率很高。所以F因子是染色體外的遺傳結(jié)構(gòu)，即質(zhì)粒。（五）F因子的特性高頻重組菌（high frequency recombination，Hfr）：從F+菌株中可以得到重組頻率高于F+菌株1000倍的菌株,是由F因子通過同源重組整合到宿主染色體上形成的。1.F和F能雜交，Hfr和F菌株能接合，F(xiàn)和F不能接合。 2.F和Hfr細(xì)胞表面有性菌毛，F(xiàn)細(xì)胞表面沒有性菌毛，性菌毛與細(xì)菌接合有關(guān)。 3.Hfr菌與F菌接合后F很少變?yōu)镕，F(xiàn)與F接合后，F(xiàn)常變

6、為F。 4.Hfr細(xì)菌經(jīng)吖啶橙處理后，性質(zhì)不變，F(xiàn)經(jīng)吖啶橙處理后變?yōu)镕。（六）F因子的遺傳結(jié)構(gòu)F因子是一種質(zhì)粒,為環(huán)狀閉合雙漣DNA，長(zhǎng)度為94.5kb，是大腸桿菌基因組的2，其中1/3的基因與接合有關(guān)。F質(zhì)?？稍诩?xì)胞內(nèi)游離，也可以整合到宿主染色體內(nèi)。整個(gè)基因組包括：轉(zhuǎn)移區(qū)、復(fù)制區(qū)、插入?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移區(qū)§ 由23個(gè)基因組成，構(gòu)成tra操縱子。§ 這些基因分別與性菌毛的形成，轉(zhuǎn)移因子的轉(zhuǎn)移，雜交對(duì)的配對(duì)，轉(zhuǎn)移的起始有關(guān)。§ 轉(zhuǎn)移的起始區(qū)為oriT，供體F質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移從oriT開始。復(fù)制區(qū)§ 復(fù)制區(qū)負(fù)責(zé)質(zhì)粒的自我復(fù)制。§ F質(zhì)粒的自主復(fù)制區(qū)中包含復(fù)制的起點(diǎn)。

7、§ F質(zhì)粒的復(fù)制是按型方式雙向復(fù)制。插入?yún)^(qū)§ F質(zhì)粒的插入?yún)^(qū)包含4個(gè)插入順序：2個(gè)IS3，1個(gè)IS2和1個(gè)Tn1000。通過和宿主染色體上的IS同源重組或通過轉(zhuǎn)座，F(xiàn)因子可以整合到宿主染色體不同位點(diǎn)上。§ 與質(zhì)粒的整合、切除、分離有關(guān)。二、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化（一）概念：細(xì)菌攝取外源DNA片段產(chǎn)生新的遺傳性狀的過程。（二）轉(zhuǎn)化發(fā)生條件Ø 建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞Ø 外源DNA游離分子感受態(tài)：把細(xì)菌能從周圍環(huán)境中吸收DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)。自然感受態(tài)：是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性，受細(xì)菌自身的基因控制。人工感受態(tài)：通過人為誘導(dǎo)的方法使細(xì)胞具有攝取DNA的

8、能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。（三）自然轉(zhuǎn)化1、概念：將不經(jīng)過特殊處理的細(xì)菌細(xì)胞從其環(huán)境中吸收DNA的過程稱為自然轉(zhuǎn)化。2、過程： 感受態(tài)的出現(xiàn) 細(xì)菌細(xì)胞在特定時(shí)期產(chǎn)生一種感受態(tài)因子，該因子與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，引起某些感受態(tài)特異蛋白質(zhì)表達(dá)，其中一種是自溶素，它可以使細(xì)胞表面的DNA結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有和DNA結(jié)合的活性。因此可以說細(xì)菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點(diǎn)就意味著細(xì)菌出現(xiàn)了感受態(tài)。結(jié)合位點(diǎn)只能與雙鏈接合，完整的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)對(duì)轉(zhuǎn)化是重要的。 DNA的結(jié)合和進(jìn)入 一般認(rèn)為，革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌在轉(zhuǎn)化過程中DNA結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞的方式有些差異。a 革蘭陽(yáng)性菌DNA的結(jié)合和進(jìn)入

9、肺炎鏈球菌為例：細(xì)胞生長(zhǎng)后期，細(xì)胞密度升高時(shí)，細(xì)胞分泌感受態(tài)因子，誘導(dǎo)感受態(tài)出現(xiàn)。雙鏈DNA結(jié)合到細(xì)胞表面特異受體上，核酸內(nèi)切酶將吸附的DNA隨機(jī)切成一些大片斷。核酸外切酶將雙鏈中一個(gè)單鏈分解掉，另一個(gè)單鏈進(jìn)入細(xì)胞。b 革蘭陰性菌DNA的結(jié)合和進(jìn)入流感嗜血菌為例：首先在感受態(tài)細(xì)胞的形成過程中，流感嗜血菌會(huì)形成一種能結(jié)合雙鏈DNA的膜結(jié)構(gòu)，叫做轉(zhuǎn)化小體，該結(jié)構(gòu)將雙鏈DNA吸收后，能使DNA免受外源DNA酶的降解。轉(zhuǎn)化小體位于細(xì)胞膜表面，與細(xì)胞的內(nèi)外膜融合。DNA被吸收到轉(zhuǎn)化小體后，雙鏈被降解為單鏈，單鏈進(jìn)入細(xì)胞。 DNA的整合單鏈DNA進(jìn)入細(xì)胞后，不經(jīng)復(fù)制便以單鏈的形式與受體DNA的同源部分配對(duì)

10、（可以設(shè)想受體DNA由于處于復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或其他原因而呈單鏈）。供體DNA和受體DNA形成共價(jià)鍵，被交換下來的一小段受體單鏈DNA被核酸酶所分解。 總結(jié)：轉(zhuǎn)化因子與染色體的整合取決于幾個(gè)因素1.受體細(xì)胞的感受態(tài)。 2.受體與供體DNA的同源性。 3.受體細(xì)胞的限制系統(tǒng)，可決定轉(zhuǎn)化因子在整合前是否被分解。 4.線狀供體的DNA比環(huán)狀質(zhì)粒的DNA整合效率更高一些。（四）人工轉(zhuǎn)化：1、Ca2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化： 1）將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌置入0的CaCl2 低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2 使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)； 2）此

11、時(shí)加入DNA，Ca 2 又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上； 3）經(jīng)短暫的42熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 本方法的關(guān)鍵是選用的細(xì)菌必須處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)操作必須在低溫下進(jìn)行。2、PEG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化： 在高滲培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用含有適量溶菌酶的等滲緩沖液處理，剝除其細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體，它喪失了一部分定位在膜上的DNase，有利于雙鏈環(huán)狀DNA分子的吸收。此時(shí)，再加入含有待轉(zhuǎn)化的DNA樣品和PEG的等滲溶液，均勻混合。通過離心除去聚乙二醇，將菌體涂布在特殊的固體培養(yǎng)基上，再生細(xì)胞

12、壁，最終得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。這種方法不僅適用于芽孢桿菌和鏈霉菌等革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，也對(duì)酵母菌、霉菌甚至植物等真核細(xì)胞有效。只是不同種屬的生物細(xì)胞，其原生質(zhì)體的制備與再生的方法不同。 3、電穿孔驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)化： 電穿孔是一種電場(chǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞膜可滲透化處理技術(shù)。受體細(xì)胞在電場(chǎng)脈沖的作用下，細(xì)胞壁上形成一些微孔通道，使得 DNA分子直接與裸露的細(xì)胞膜脂雙層結(jié)構(gòu)接觸，并引發(fā)吸收過程。具體操作程序因轉(zhuǎn)化細(xì)胞的種屬而異。 。雖然電穿孔法轉(zhuǎn)化較大重組質(zhì)粒（100Kb）的轉(zhuǎn)化效率比小質(zhì)粒（3Kb）低一千倍，但這比Ca2 誘導(dǎo)和PEG轉(zhuǎn)化方法理想，因?yàn)檫@兩種方法幾乎不能轉(zhuǎn)化大于100Kb的質(zhì)粒DNA。 4、基因槍法 三、轉(zhuǎn)導(dǎo)（

13、一）概念：以噬菌體為媒介，將供體菌DNA片段轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)，使受體菌獲得新的遺傳性狀。（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) 1952年，Lederberg和他的學(xué)生把鼠傷寒沙門菌的一個(gè)突變菌株LT22（try）和另一個(gè)突變菌株LT2（his）混合培養(yǎng)物在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果在107個(gè)細(xì)胞中得到大約100個(gè)重組菌。為進(jìn)一步驗(yàn)證傷寒沙門菌是否通過細(xì)胞接合而產(chǎn)生重組體又進(jìn)行了U形管實(shí)驗(yàn)，在接種LT22的一端出現(xiàn)重組菌。說明沙門菌的重組不是通過細(xì)胞接合，而是通過某些可濾因子。通過一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可濾因子具有一些特性 不因DNA酶處理而失活。 因加熱失活，抗P22血清處理也失活。 和從溶源性LT22菌株獲得的噬菌體（P

14、22）具有相同的大小和質(zhì)量。 把P22的LT2和LT22菌株混合培養(yǎng)，在基本培養(yǎng)基上出現(xiàn)重組菌。結(jié)論：基因的傳遞很可能是由可透過“U”型管濾板的P22噬菌體介導(dǎo)的（三）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，只能使供體的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因轉(zhuǎn)移到受體的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。 噬菌體為例：噬菌體感染宿主菌后，它的染色體由線狀變?yōu)榄h(huán)狀。這一環(huán)狀DNA分子以它的附著位點(diǎn)attP和細(xì)菌染色體DNA同源位點(diǎn)attB作用，通過一次交換整合到宿主染色體中。通過相反的過程噬菌體可以脫離宿主染色體而成為游離的噬菌體，這一過程稱為切離。如果切離的位置有偏差則成為帶有宿主染色體的噬菌體，成為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體在帶有宿主細(xì)胞一部分染色體的

15、同時(shí)必然失去自己的一部分染色體。（四）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：宿主基因組任意位置的DNA成為成熟噬菌體顆粒DNA一部分而被帶入受體菌。四、轉(zhuǎn)染：噬菌體、病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)胞、或外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)染。五、轉(zhuǎn)座：大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置。這些可在DNA分子間進(jìn)行轉(zhuǎn)移的DNA片段，稱為轉(zhuǎn)座因子（或）可移動(dòng)因子。由可移動(dòng)因子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座。（一）原核生物的轉(zhuǎn)座子1、插入序列（insertion sequence, IS）組成： 反向重復(fù)序列（IR)：位于兩側(cè),在IS的切割和DNA鏈的轉(zhuǎn)移中起作用。 轉(zhuǎn)座酶編碼基因：位于

16、中間，產(chǎn)物引起轉(zhuǎn)座，負(fù)責(zé)識(shí)別切割轉(zhuǎn)座子的兩端及在靶部位造成切口。 正向重復(fù)序列：位于反向重復(fù)序列外側(cè)，為插入序列所特有。2、轉(zhuǎn)座子 （transposon, Tn）：是較復(fù)雜的轉(zhuǎn)座因子，除含轉(zhuǎn)座酶基因外還含有抗性或其他基因。分為兩類： 復(fù)合轉(zhuǎn)座子：通常兩端為順向或反向重復(fù)的插入序列作為兩臂，中間為標(biāo)記基因。 復(fù)雜轉(zhuǎn)座子：兩端不帶插入序列，但有反向重復(fù)序列。中央是轉(zhuǎn)座酶基因和抗藥性基因。3、 Mu噬菌體Mu噬菌體遺傳圖：線狀雙鏈分子，游離Mu噬菌體DNA的兩端連接一段宿主DNA，左端約長(zhǎng)100bp，右端約長(zhǎng)1500bp。這兩段宿主DNA序列在不同Mu噬菌體DNA上各不相同。 Mu噬菌體基因組有以

17、下特征： 基因A和B分別編碼轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座輔助蛋白。 C基因產(chǎn)物對(duì)轉(zhuǎn)座酶基因的表達(dá)起阻遏作用。 轉(zhuǎn)座時(shí)需要Mu噬菌體的兩個(gè)末端，即attL和 attR。 當(dāng)Mu噬菌體DNA被包被在噬菌體頭部時(shí)，DNA的左末端帶有100bp的宿主DNA，右末端帶有約長(zhǎng)1500bp的宿主DNA。 當(dāng)Mu噬菌體浸染宿主時(shí)，其線形DNA進(jìn)入細(xì)胞后， Mu噬菌體DNA通過剪-貼型的非復(fù)制方式，插入到宿主染色DNA的任意部位，成為原噬菌體。原噬菌體兩側(cè)各有一個(gè)5bp重復(fù)。原噬菌體：在大多數(shù)情況下，溫和噬菌體的基因組都整合于宿主的染色體中（如噬菌體），也有少數(shù)是以質(zhì)粒形成存在（如P1噬菌體）。整合于細(xì)菌染色體或以質(zhì)粒形式存在

18、的溫和噬菌體基因組稱作原噬菌體。 溶源化的野生型噬菌體相當(dāng)穩(wěn)定，但Mu噬菌體的突變株，如溫度敏感抑制型- MuCts，則可通過將溫度提高到42而誘導(dǎo)其進(jìn)入裂解循環(huán)。這是因?yàn)樵撏蛔凅w中的阻遏基因C失活，則噬菌體基因組中的A蛋白和B蛋白大量表達(dá)，表達(dá)的A和B轉(zhuǎn)座酶通過復(fù)制型轉(zhuǎn)座機(jī)制使Mu插入到宿主染色體上50-100個(gè)新的位點(diǎn)。同時(shí)，噬菌體的晚期基因開始表達(dá)，如編碼噬菌體頭部、尾部、裂解蛋白等，然后從噬菌體DNA左端約50-150bp處的宿主DNA進(jìn)行切割，右末端也帶有1-2kb的宿主DNA，進(jìn)行包裝。（二）轉(zhuǎn)座機(jī)制 非復(fù)制轉(zhuǎn)座 ：轉(zhuǎn)座酶識(shí)別轉(zhuǎn)座子末端反向重復(fù)序列，并在3端切開，同時(shí)在靶部位交錯(cuò)切

19、開單鏈，它的5端與轉(zhuǎn)座子的3端連接，形成中間體。轉(zhuǎn)座子從原來位置上切下來轉(zhuǎn)入新的位置，兩條鏈均被保留。 復(fù)制轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座酶識(shí)別轉(zhuǎn)座子末端反向重復(fù)序列，并在3端切開，同時(shí)在靶部位交錯(cuò)切開單鏈，它的5端與轉(zhuǎn)座子的3端連接，形成中間體。在形成靶部位與轉(zhuǎn)座子連接中間體后即進(jìn)行復(fù)制。通過復(fù)制使原來位置與靶部位各有一個(gè)轉(zhuǎn)座子。一條鏈?zhǔn)窃械模硪粭l鏈?zhǔn)切潞铣傻摹?剪-貼型轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座酶識(shí)別轉(zhuǎn)座因子的兩個(gè)末端，在轉(zhuǎn)座因子的兩個(gè)末端進(jìn)行雙鏈平端切割，完整的轉(zhuǎn)座子從供體 DNA中釋放出來。同時(shí)轉(zhuǎn)座酶在受體的靶部位進(jìn)行交錯(cuò)切割，轉(zhuǎn)座子與靶部位的切口末端相連接。（三）轉(zhuǎn)座的遺傳學(xué)效應(yīng) 引起插入突變或啟動(dòng)沉默基因。 插入

20、新的基因。 原來位置保留轉(zhuǎn)座因子。 造成靶DNA缺失倒位。 切離 生物進(jìn)化第二節(jié) 基因的遺傳重組一、同源重組（一）概念：又稱一般重組，由兩條同源區(qū)的DNA分子，通過配對(duì)，鏈的斷裂和再連接，而產(chǎn)生片段交換的過程。同源重組的分子模型分為三種：（二）分類1、Holliday雙鏈侵入模型 兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊。 在DNA內(nèi)切酶的作用下，兩個(gè)同源的非姐妹染色單體DNA分子在相應(yīng)位置同時(shí)切開。 切開的單鏈交換重接，形成連接分子，稱為Holliday中間體。 通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈。 交叉結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生Holliday中間體的異構(gòu)體。 Holliday中間體切開，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA。2、 單

21、鏈侵入模型（Meselsonradding模型） 兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊。 在DNA內(nèi)切酶的作用下，兩個(gè)同源的DNA分子中的一個(gè)單鏈在隨機(jī)的位置被切開。 切開的單鏈末端侵入另一個(gè)雙鏈DNA分子中，直到發(fā)現(xiàn)它的互補(bǔ)序列，并替代一條與它相同的鏈。 DNA聚合酶將利用留下的一條鏈作為模板，填補(bǔ)侵入的鏈留下的缺口。 被替代的鏈降解，它的殘留末端與另一分子中新合成的鏈連接，形成連接分子，為Holliday中間體。 產(chǎn)生Holliday中間體的異構(gòu)體。 Holliday中間體切開，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA。3、 雙鏈斷裂修復(fù)模型 參與重組的一對(duì)DNA分子之一的兩條鏈斷裂。 核酸外切酶進(jìn)一步作用，將雙

22、鏈斷裂處加工成帶有3末端單鏈突出的缺口。 單鏈突出的3末端侵入另一個(gè)同源染色體。修復(fù)合成填補(bǔ)缺口，形成兩個(gè)Holliday中間體，分支移動(dòng)。 兩個(gè)Holliday中間體拆分。（三）同源重組的酶學(xué)機(jī)制1、RecA蛋：參與同源重組的酶至少有27種，包括重組酶，解旋酶，外切核酸酶等，其中以重組酶RecA最為重要。RecA基因突變可以使同源重組頻率降低到10-6以下。 單鏈結(jié)合活性：ssDNA結(jié)合力比dsDNA結(jié)合力強(qiáng)100倍。平均一個(gè)RecA單體結(jié)合4個(gè)核苷酸，這種結(jié)合相當(dāng)穩(wěn)定,ATP的存在可促進(jìn)結(jié)合。 雙鏈DNA結(jié)合活性：pH 6.0, 必需有ATP存在。 雙鏈解旋作用：由于RecA的結(jié)合，使雙鏈DNA發(fā)生解 鏈。