骨肉瘤微血管密度及其臨床意義

1、    骨肉瘤微血管密度及其臨床意義        【摘要】目的探討骨肉瘤組織中微血管密度(MVD）與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測48例骨肉瘤組織標(biāo)本中的MVD計(jì)數(shù)，并結(jié)合臨床及隨訪資料綜合分析患者年齡、發(fā)病時(shí)間、腫瘤大小、組織亞型、HDMTX化療以及腫瘤轉(zhuǎn)移與骨肉瘤MVD之間的關(guān)系。結(jié)果MVD與患者年齡、發(fā)病時(shí)間、組織亞型及是否化療無關(guān)，但HDMTX明顯影響腫瘤微血管的發(fā)育成熟，且腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移者的MVD顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移者。結(jié)論骨肉瘤組織中的MVD可能影響

2、骨肉瘤患者的預(yù)后，HDMTX抑制腫瘤血管發(fā)育可能是其能控制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的原因之一?！娟P(guān)鍵詞】骨肉瘤； 免疫組織化學(xué)； 微血管密度； 預(yù)后【中分類號】R738.1Clinical significance of microvessel density in osteosarcomaCai Xuansong，Mei Jiong，Li Rile，Guo Diping(Department of Orthopaedics,Ganquan Hospital,Medical College of Shanghai Tiedao University，Shanghai200065)【Abstract】Ob

3、jectiveTo investigate the prognostic value of microvessel density(MVD) in osteosarcoma. MethodsMicrovessel quantitation was detected by immunohistochemistry in histological sections from 48 patients with osteosarcoma,and the statistical significance was analysed between MVD and patient?s age,duratio

4、n of symptoms,tumor size,pathologic subtype or chemotherapy. ResultsMVD was significantly higher in the metastatic group than that in non-metastatic group,and no association was observed between MVD and patient?s age,duration of symptoms,pathologic subtype or chemotherapy. Although the microvessel q

5、uantitation showed no significant difference between the patients with chemotherapy and those without, chemotherapy restrained microvessel from maturity. ConclusionHigh MVD in osteosarcoma was correlated with poor prognosis， and the microvessel maturity restrained by chemotherapy would be one reason

6、 of tumor metastasis.【Key words】osteosarcoma;immunohistochemistry;microvessel density; prognosis實(shí)體腫瘤的生長要依靠腫瘤血管生成以形成自身的血管系統(tǒng)，腫瘤組織因此能得到充足的營養(yǎng)供給而迅速生長。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞也憑借新生血管在結(jié)構(gòu)上的缺陷，進(jìn)入微循環(huán)而向遠(yuǎn)方轉(zhuǎn)移1，2。目前有關(guān)腫瘤血管生成與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系以及抗血管生成在腫瘤治療上的運(yùn)用，為國內(nèi)外較多學(xué)者所注目。本研究應(yīng)用第因子(F)相關(guān)抗原多克隆抗體對48例骨肉瘤的微血管密度(MVD)進(jìn)行免疫組化研究，以探討骨肉瘤微血管密度的臨床意義。1材料與方法1

7、.1病例來源按以下條件選擇病例：(1) 我院19911995年間因骨肉瘤行保肢手術(shù)或截肢術(shù)的所有患者。(2)來我院前未經(jīng)手術(shù)治療或活檢手術(shù)的時(shí)間不超過2周者。(3)病損部位在四肢，就診時(shí)無轉(zhuǎn)移并可根治切除。(4)手術(shù)由同一外科小組施行。(5)病理診斷由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師分別閱片后得出并作出組織亞型分類。(6)手術(shù)前后有完整的病案資料；隨訪時(shí)間：從術(shù)后到發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，無轉(zhuǎn)移者隨訪36個(gè)月以上。(7)有腫瘤原發(fā)灶組織的蠟塊保存。1.2臨床資料符合以上條件者48例，其中男22例，女26例。年齡949歲。首診到手術(shù)日病程111月，平均4.1個(gè)月。所有腫瘤均穿破骨皮質(zhì)侵犯軟組織，腫瘤最大徑325 cm，平

8、均9.89 cm。治療方法：化療采用MTXVCR方案（劑量MTX 200 mg.kg-1，VCR 2 mg），術(shù)前化療1次后施行手術(shù)，術(shù)后化療于術(shù)后2周開始，第1年每34周重復(fù)1次，劑量同前，每3個(gè)月間以ADM 30 mg.m-2。第2年每3個(gè)月進(jìn)行1次，到術(shù)后2年化療結(jié)束。48例患者中34例術(shù)前術(shù)后接受了完整的化療，14例因經(jīng)濟(jì)困難或化療反應(yīng)未能堅(jiān)持全程化療，其中6例未行術(shù)前化療。手術(shù)分截肢和保肢兩類，一般盡可能采用保肢手術(shù)。截肢指征：(1)主要血管神經(jīng)受侵；(2)腫瘤切除后骨缺損重建困難而又無經(jīng)濟(jì)能力支付假體費(fèi)用。本組中截肢17例，肢體挽救31例。本組中骨肉瘤的組織亞型包括骨母細(xì)胞型28例

9、，軟骨母細(xì)胞型10例，纖維母細(xì)胞型6例，毛細(xì)血管擴(kuò)張型3例，小細(xì)胞型1例。1.3免疫組化技術(shù)（ABC法）切片常規(guī)脫蠟，水化。用0.05%(體積分?jǐn)?shù)，下同)胰蛋白酶消化約15 min，TBS洗滌，滴加1100的抗F相關(guān)抗原多克隆抗體(DAKO，兔抗)，4過夜。次日用TBS洗滌3次，再以3% H2O2阻斷5 min，TBS洗滌后滴加1200的生物素化兔二抗(DAKO)，30 min后TBS洗滌3次滴加1100的ABC試劑(DAKO)，1 h后TBS洗滌3次，在0.03% H2O2-DAB中染色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，風(fēng)干，樹膠封固。以上步驟均在室溫下進(jìn)行。1.4結(jié)果判斷及微血管計(jì)數(shù)

10、方法微血管染色呈棕色，為單個(gè)或成簇的細(xì)胞，可有或無血管腔（1）。但如果血管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞或血管壁帶有明顯的肌層或纖維化以及炎癥和壞死區(qū)的微血管則不計(jì)入總數(shù)3。計(jì)數(shù)時(shí)先用40倍鏡尋找微血管最多的區(qū)域，然后用200倍鏡（視野的面積為0.74 mm2）分別對3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，其平均值即為該腫瘤的微血管密度值。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)。1微血管染色呈棕色，為單個(gè)或成簇的細(xì)胞，可有或無血管腔(免疫組化，ABC×200)2結(jié)果2.1微血管分布情況微血管大多集中在腫瘤邊緣，腫瘤之間的微血管數(shù)量差異較大。微血管在各腫瘤中分布的規(guī)則狀況差異也較大，一些腫瘤的微血管分布比較規(guī)則，而另一些腫瘤的微

11、血管分布則較為凌亂。2.2MVD與臨床各指標(biāo)間關(guān)系MVD與患者年齡、發(fā)病時(shí)間、腫瘤大小、組織亞型（毛細(xì)血管型和小細(xì)胞型因例數(shù)較少未納入統(tǒng)計(jì)）、化療與否以及腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系見表1。表1MVD與臨床各指標(biāo)間的關(guān)系指標(biāo)n±s范圍年齡>16歲2336.8±13.13378<16歲2539.7±14.711106發(fā)病時(shí)間>4個(gè)月2038.1±14.21172<4個(gè)月2841.3±12.834106腫瘤大小>10 cm2337.2±15.011106<10 cm2537.7±14.72198組織亞型

12、骨母細(xì)胞型2842.1±14.51196軟骨母細(xì)胞型1036.8±13.826106纖維母細(xì)胞型639.1±14.43286術(shù)前化療化療4237.4±14.111106無化療639.5±13.42282腫瘤轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移2944.8±13.2?36106無轉(zhuǎn)移1936.6±13.11182與無轉(zhuǎn)移比較：*P<0.052.3MVD與化療的關(guān)系本組資料中，6例患者未行術(shù)前化療，為探討化療對MVD的影響，我們將這6例骨肉瘤組織與42例行術(shù)前化療者的MVD作了比較，兩組間MVD經(jīng)t檢驗(yàn)差異無顯著性。但未行化療者的微血管發(fā)育明顯較已行

13、化療者為好，前者微血管管腔豐富并密集成網(wǎng)絡(luò)狀（2），而后者則多為單個(gè)或成簇細(xì)胞，形成管腔者明顯為少（3）。2未行化療者微血管管腔豐富并密集成網(wǎng)絡(luò)狀(免疫組化，ABC×200)3化療者見單個(gè)或成簇染色細(xì)胞，形成管腔者明顯為少(免疫組化，ABC×200)3討論腫瘤血管系統(tǒng)的生成雖然是一個(gè)連續(xù)的過程，但仍可分為6個(gè)相對獨(dú)立的步驟4：(1)腫瘤的各種成分釋放多種血管生成因子；(2)血管內(nèi)皮細(xì)胞因血管生成因子的作用而出現(xiàn)形態(tài)改變（如各種細(xì)胞器數(shù)目和大小的增加以及偽足的出現(xiàn)）；(3)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放蛋白溶酶以降解毛細(xì)血管基底膜和周圍的細(xì)胞外基質(zhì)；(4)血管內(nèi)皮細(xì)胞從毛細(xì)血管后

14、微靜脈遷出形成血管新芽；(5)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖（也有人認(rèn)為可不出現(xiàn)1）；(6)腫瘤微血管分化和成型。因此，測定腫瘤MVD是研究腫瘤血管生成的主要方法之一5。腫瘤血管生成之所以為當(dāng)今學(xué)者所注目，除了其與患者預(yù)后密切相關(guān)外，抗腫瘤血管生成有可能成為治療腫瘤的重要方法6。和其它研究結(jié)果相似，我們的結(jié)果顯示骨肉瘤的微血管多分布在腫瘤邊緣且不規(guī)則，數(shù)量懸殊也較大，這可能是腫瘤血管生成的一般規(guī)律。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道MVD隨患者年齡升高而下降，但在我們的結(jié)果中，MVD則與年齡無關(guān)，這可能是由于骨肉瘤患者多為青少年之故。有關(guān)發(fā)病時(shí)間，組織亞型以及化療等影響骨肉瘤患者預(yù)后的文獻(xiàn)7不少，但結(jié)論各異。本實(shí)驗(yàn)對一些可能相

15、關(guān)因素與MVD的關(guān)系也進(jìn)行了探討，其間并無顯著相關(guān)，說明腫瘤血管生成是腫瘤自身生物行為的作用結(jié)果。轉(zhuǎn)移是腫瘤預(yù)后不良的主要原因，但轉(zhuǎn)移的機(jī)制至今仍不明了。有關(guān)MVD與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，不少學(xué)者3，5認(rèn)為兩者密切相關(guān)，本研究也得出相同的結(jié)果，即在發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤病例中，其MVD明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移者。這一方面固然是由于在微血管豐富的腫瘤中，腫瘤細(xì)胞更易于進(jìn)入血循環(huán)，另一方面，Lamoreaux等8的研究表明，主要促使腫瘤血管生成的血管內(nèi)皮生長因子可以調(diào)節(jié)明膠酶以及金屬蛋白酶及其組織抑制劑的活性，從而進(jìn)一步助長了腫瘤的侵襲能力。影響骨肉瘤預(yù)后的因素很多7，8，年齡、發(fā)病部位、組織亞型等均對其預(yù)后有一定

16、的影響，但20多年來，對骨肉瘤預(yù)后影響最大的是輔助化療的廣泛運(yùn)用，本資料中顯示，在未用化療的腫瘤中，其微血管發(fā)育明顯較已用化療者為好，而在用過化療的腫瘤中，雖然較多腫瘤內(nèi)亦可見豐富的染色細(xì)胞，卻較少形成微血管，這提示輔助化療改善骨肉瘤患者預(yù)后的基礎(chǔ)，很可能與化療藥物抑制了腫瘤微血管形成有關(guān)。作者簡介：蔡宣松，男，43歲，副教授，碩士生導(dǎo)師，科主任。研究方向：骨腫瘤作者單位：上海鐵道大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬甘泉醫(yī)院骨科，上海200065參考文獻(xiàn)1Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Ca

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