可見光分光光度法

1、第10章 可見光分光光度法(Visible Spectrophotometry)基于物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱吸光光度法，它包括比色法（colorimetric method）和分光光度法（spectorphotometry）。比色法是通過比較有色溶液顏色深淺來確定有色物質含量的；分光光度法是通過物質對光的選擇性吸收來測定組分含量的，它包括紫外分光光度法（ultra violet spectrophotometry）、可見光分光光度法（visible spectrophotometry）、紅外分光光度法（infrared spectrophotometry）等。可見光分光光度法

2、具有靈敏度高、準確性好、儀器設備簡單、操作簡便快捷等特點，許多無機物都可直接或間接地用此法進行測定。此法不僅用于組分定性、定量分析，還可用于對化學平衡及配合物組成的研究等。10.1 可見光分光光度法基本原理10.1.1 物質對光的選擇性吸收與物質顏色的關系光是一種電磁波。電磁波譜的波長（或頻率）范圍很廣，其中人眼能感覺到的可見光的波長范圍是400750nm。單色光（chromatic light）是僅具有單一波長的光，復合光是由不同波長的光所組成的，人們肉眼所見的白光（如日光等）和各種有色光，實際上都是包含一定波長范圍的復合光（polychromatic light）。圖10-1 光的互補色白

3、光物質呈現的顏色與光有著密切的關系。一束白光（日光、白熾電燈光、熒光燈光等）通過三棱鏡，可分解為紅、橙、黃、綠、青、藍、紫七種色光，這種現象稱光的色散。實驗證明，不僅這七種色光可以混合組成白光，圖10-1中處于直線關系的兩種單色光按一定強度比例混合，也可組成白光。這兩種單色光就稱為互補色，如綠光和紫光互補，藍光和黃光互補，等等。 當一束光照射某物質時，若該物質的分子（或離子）與光子發(fā)生有效碰撞，則光子的能量就轉移到分子（或離子）上，分子由基態(tài)躍遷到高能級的激發(fā)態(tài)，此過程即為光的吸收。激發(fā)態(tài)分子的壽命極短，約10-8s后通過下面兩種方式放出吸收的能量返回到基態(tài)： M（基態(tài)）+ hv M*（激發(fā)態(tài)

4、）由于分子的能級是量子化的，因此分子吸收能量同樣具有量子化的特征，即用不同波長的光照射物質時，其分子只選擇吸收具有與其能級間隔相應的波長的光子的能量，其余波長的光只是簡單透過，這就是該物質分子對光的選擇性吸收特征。物質呈現不同的顏色正是由于物質分子選擇性地吸收了某一波長范圍的光而造成的。圖10-2 溶液對光的吸收作用示意圖ItI0b固體物質呈現不同的顏色是由于其對不同波長的光吸收、透射、反射、折射的程度不同而造成的。如果物質對各種波長的光完全吸收，則呈現黑色；如果完全反射，則呈現白色；如果對各種波長的光吸收程度差不多，則呈現灰色；如果選擇性地吸收某些波長的光，那么該物質的顏色就由它所反射或透射

5、光的顏色來決定。 如圖10-2所示，溶液呈現不同的顏色是由于溶液中的質點（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光引起的，溶液的顏色由透射光的波長所決定。透射光和吸收光是互補色，可以組成白光。例如，硫酸銅溶液因吸收了白光中的黃色而呈藍色。如果溶液對各種顏色的光吸收程度差不多，光透射程度相同，則該溶液就是無色透明的。物質顏色（透過光）與吸收光顏色的互補關系見表10-1。表10-1 物質顏色（透過光）與吸收光顏色的互補關系物質顏色吸 收 光物質顏色吸 收 光顏 色波長/nm顏 色波長/nm黃 綠黃橙紅紫 紅紫藍綠 藍藍 綠綠400450450480480490490500500560紫藍綠 藍藍 綠黃

6、 綠黃橙紅560580580600600650650750圖10-3 1,10-鄰二氮雜菲亞鐵溶液的吸收曲線任何一種溶液，對不同波長的光的吸收程度是不同的。溶液對各種單色光的吸收程度用吸光度A（absorbance）來描述。以波長（單位nm）為橫坐標，以測得的吸光度A為縱坐標，可得一條曲線，稱為吸收曲線（absorption curve）。吸收曲線清楚地描述了溶液對不同波長的光的吸收情況。如圖10-3所示，曲線a、b、c分別是濃度為0.0002mgml-1、0.0004mgml-1、0.0006mgml-1的1，10-鄰二氮雜菲亞鐵溶液的吸收曲線。在=510nm處，吸光度A最大，所對應的波長稱

7、為最大吸收波長max。不同物質的吸收曲線的形狀和最大吸收波長不同，說明光的吸收與溶液中物質的結構有關，根據這一特性可用作物質的初步定性分析。不同濃度的同一物質，吸光度隨濃度的增加而增大，尤其在最大吸收峰附近吸光度的變化更加明顯。若在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度最高。因此，吸收曲線是分光光度法中選擇測定波長的重要依據。10.1.2 光吸收的基本定律吸光光度法進行定量分析的理論依據是朗伯-比耳定律。如圖10-2所示，當一束平行單色光（光強度I0）通過厚度為b的均勻、非散射的溶液時，溶液吸收了光能，光的強度就要減弱。溶液的濃度越大，液層越厚，則光被吸收得越多，透過溶液的光強度（即透射光的強度I

8、t）越弱。溶液的吸光度A與光強度的關系如下： (10-1)透光度T描述入射光透過溶液的程度： (10-2)透光度的負對數即為吸光度：A= -lgT (10-3) 實踐證明，溶液對光的吸收程度與該溶液的濃度、液層厚度以及入射光的強度等因素有關。如果保持光強度不變，則光的吸收程度與溶液的濃度和液層厚度有關。1760年朗伯（Lambert）提出溶液的濃度一定時，溶液對光的吸收程度與液層厚度成正比；1852年比耳（Beer）又提出光的吸收程度與吸光物質濃度成正比。二者的結合稱朗伯-比耳定律，其數學表達式為： A=bc (10-4) 式中A：吸光度；b：液層厚度（光程長度），單位cm；c：物質的量濃度，

9、單位molL-1；：摩爾吸光系數，單位Lmol-1cm-1。 摩爾吸光系數是吸光物質在一定波長和溶劑條件下的特征常數。在溫度和波長等條件一定時，僅與吸光物質本身的性質有關，因此，摩爾吸光系數可作為物質定性鑒定的參數。同一物質在不同波長下的是不同的，在最大吸收波長max處的摩爾吸光系數常以max表示。max表明了該吸光物質最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質可能達到的最大靈敏度。max值越大，表明該物質的吸光能力越強，用光度法測定該物質的靈敏度越高。一般max的值在104105 Lmol-1cm-1為靈敏度較高。由=A/bc可以看出，摩爾吸光系數在數值上等于濃度為1molL-1、液層厚度

10、為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。但由于光度法只適用于測定微量組分，不能直接測得像1molL-1這樣高濃度溶液的吸光度，因此，通常根據低濃度時的吸光度間接計算求得摩爾吸光系數。朗伯-比耳定律廣泛應用于紫外、可見、紅外光區(qū)的吸收測量。該定律不僅適用于溶液，也適用于其他均勻、非散射的吸光物質（包括氣體和固體）。對于多組分體系，若體系中各組分間無相互作用，則各組分i的吸光度Ai有加和性。設體系中有n個組分，則在任一波長處的總吸光度A為： A=A1+ A2+ Ai + =1bc1+2bc2+ +ibci+ (10-5)例10-1濃度為5.010-4gL-1的Fe2+溶液，與1,10-鄰二氮雜菲反應

11、生成橙紅色配合物，該配合物在508nm、比色皿厚度2.0cm時，測得A=0.19。計算1,10-鄰二氮雜菲亞鐵的。解 根據A=bc得 10.1.3 偏離朗伯-比耳定律的原因 當入射光波長及吸收池光程一定時，吸光度A與吸光物質的濃度c呈線性關系。以某物質的標準溶液濃度c為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，繪出A-c曲線，稱為標準曲線。在相同條件下測定待測溶液的吸光度，即可通過標準曲線求得待測溶液的濃度。在實際工作中，尤其當溶液濃度較高時，標準曲線往往偏離直線，這種現象稱為對朗伯-比耳定律的偏離（如圖10-4所示）。引起這種偏離的因素很多，歸結起來可分為兩大類。圖10-4 標準曲線及對朗伯-比耳定律的偏

12、離（1）非單色光引起的偏離朗伯-比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光，但即使是現代高精度分光光度計也難以獲得真正的純單色光。大多數分光光度計只能獲得近乎單色光的狹窄光帶，它仍然是具有一定波長范圍的復合光，而復合光可導致對朗伯-比耳定律的正或負偏離。圖10-5 非單色光的影響l2l1為了克服非單色光引起的偏離，首先應選擇較好的單色器。此外還應將入射波長選定在待測物質的最大吸收波長max處，這不僅是因為在max處能獲得最大靈敏度，還因為在max附近的一段范圍內吸收曲線較平坦，即在max附近各波長光下吸光物質的摩爾吸光系數大體相等。圖10-5（a）為吸收曲線與選用譜帶之間關系，圖10-5（b）為標

13、準曲線。若選用吸光度隨波長變化不大的譜帶M的復合光作入射光，則吸光度變化較小，即的變化較小，引起的偏離也較小，A與c基本成直線關系。若選用譜帶N的復合光測量，則的變化較大，A隨波長的變化較明顯，因此出現較大偏離，A與c不成直線關系。 （2）化學性因素化學性因素主要有兩種：一種是吸光質點（分子或離子）間相互作用，另一種來自化學平衡。按照朗伯-比耳定律的假定，所有的吸光質點之間不發(fā)生相互作用。但實驗證明只有在稀溶液（c10-2molL-1）時才基本符合。當溶液濃度較大時，吸光質點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了它對光的吸收。因此，朗伯-比耳定律只適用于稀溶液。 另外，溶液中存在著解離、締合、互

14、變異構、配合物的形成等化學平衡，化學平衡與濃度、pH等其他條件密切相關。不同條件可導致吸光質點濃度變化，吸光性質發(fā)生變化而偏離朗伯-比耳定律。例如，在鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：2CrO42- + 2H+ Cr2O72- + H2OCrO42-、Cr2O72-的顏色不同，吸光性質也不同。用光度法測定CrO42-或Cr2O72-含量時，溶液濃度及酸度的改變都會導致平衡移動而發(fā)生對朗伯-比耳定律的偏離，為此應加入強堿或強酸作緩沖溶液以控制酸度，如用光度法測定0.001molL-1HClO4中的K2Cr2O7溶液及0.05 molL-1KOH中的K2CrO4溶液，均能獲得非常滿意的結果。10

15、.2 可見光分光光度法10.2.1 分光光度計的基本部件可見光分光光度法采用棱鏡或光柵等色散元件構成單色器得到純度較高的單色光。分光光度法采用分光光度計測量溶液的透光度或吸光度。其基本原理是：光源發(fā)射的光經單色器獲得實驗所需的單色光，再透過吸收池照射到光電元件（光電管或光電池）上，所產生的光電流大小與透射光的強度成正比，通過測量光電流強度即可得到溶液的透光度或吸光度。分光光度計的種類和型號繁多，其基本部件如下：光源 單色器 吸收池 檢測系統（1）光源在可見光區(qū)測量時，一般用鎢絲燈作光源。鎢絲加熱到白熾時，其輻射波長范圍約320nm2500nm。溫度升高，輻射總強度增大，在可見光區(qū)的強度分布也增

16、大，但同時會減少燈的壽命。碘鎢燈通過在燈泡內引入少量碘蒸氣較好地克服了這一缺點，具有更大的發(fā)光強度和更長的使用壽命。在近紫外-可見分光光度計中廣泛用碘鎢燈作光源。要保持光源的穩(wěn)定性，必須配有很好的穩(wěn)壓電源。 （2）單色器單色器（monochromator）是能將光源發(fā)射的連續(xù)光譜（復合光）分解為單色光并從中選出任一波長單色光的光學系統，一般由棱鏡或光柵等色散元件以及狹縫和透鏡組成。圖10-6為棱鏡單色器示意圖。圖10-6 棱鏡單色器示意圖 當一束平行光通過棱鏡后，因發(fā)生折射而色散。色散后的光被聚焦在一個微微彎曲并帶有出射狹縫的表面上，轉動棱鏡或移動出射狹縫的位置，就可使所需波長的光通過狹縫進入

17、吸收池。單色光的純度取決于色散元件的色散特性和出射狹縫的寬度。使用棱鏡單色器可以獲得純度較高的單色光（半峰寬510nm），且可以方便地改變測定波長。在380800nm區(qū)域，采用玻璃棱鏡較合適。光柵根據光的衍射和干涉原理將復合光色散為不同波長的單色光，然后再讓所需波長的光通過狹縫照射到吸收池上。它的分辨率比棱鏡大，可用的波長范圍也較寬。目前多數精密分光光度計已采用全息光柵。（3）吸收池吸收池（absorption cell）又稱比色皿，用于盛裝溶液，按其液層厚度分為0.5、1、2、3cm等。比色皿具有光學潔凈的一對互相平行并垂直于光束的光學窗?？梢姽鈪^(qū)測量時一般用玻璃吸收池，有些塑料池也可在可見

18、光區(qū)使用。使用比色皿時應注意保持清潔、透明，避免磨損透光面。（4）檢測系統檢測器通常是利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管和光電倍增管。（5）結果顯示記錄系統早期的單光束分光光度計常采用懸鏡式光點反射檢流計測量光電流，其讀數標尺上有兩種刻度，等刻度的透光度T%（0100%）和非等刻度的吸光度A（0），如圖12-7所示。當吸光度較大時，讀數誤差較大。20世紀80年代后，采用屏幕顯示（吸收曲線、操作條件和結果均可在屏幕上顯示出），并利用微機進行儀器自動控制和結果處理，提高了儀器的自動化程度和測量精度。01020304050607080901001.00.70.5

19、0.40.30.20.10.050T/%A圖10-7 吸光度與透光度標尺刻度 10.2.2 顯色反應及其影響因素 有些物質本身具有吸收可見光的性質，可直接用可見光分光光度法測定。但大多數物質本身在可見光區(qū)沒有吸收或雖有吸收但摩爾吸光系數很小，因此不能直接用光度法測定。這時就需要借助適當試劑，與之反應使其轉化為摩爾吸光系數較大的有色物質后再進行測定，此轉化反應稱為顯色反應，所用試劑稱為顯色劑。 顯色反應可分為氧化還原反應和配位反應，其中配位反應是最常用的顯色反應。 （1）顯色反應及其選擇（1.1）靈敏度高有色物質摩爾吸光系數大小是顯色反應靈敏度高低的重要標志，應當選擇生成的有色物質的摩爾吸光系數

20、大于104 Lmol-1cm-1的顯色反應。（1.2）選擇性好選擇性好，指顯色劑僅與一個組分或少數幾個組分發(fā)生顯色反應。僅與某一組分發(fā)生反應的特效（或專屬）顯色反應幾乎不存在，往往所用的顯色劑會與試樣中共存組分不同程度地發(fā)生反應而產生干擾。在分析工作中，盡量選用干擾少（即選擇性高）或干擾易除去的顯色反應。高選擇性的獲得也可借助于加入掩蔽劑、控制反應條件等措施。一般來講，在滿足測定靈敏度要求的前提下，常常根據選擇性的高低來選擇顯色劑。（1.3）顯色劑在測定波長處無明顯吸收顯色劑在測定波長處無明顯吸收，試劑空白較小，可以提高測定的準確度。通常把顯色劑與有色化合物兩者最大吸收波長之差max稱為“對比

21、度”，一般要求對比度max在60nm以上。（1.4）生成的有色化合物組成恒定，化學性質穩(wěn)定這樣可以保證在測定過程中吸光物質不變，否則將影響吸光度測量的準確度和重現性。 利用氧化還原反應進行顯色的例子很多。如光度法測定鋼中微量錳的含量，鋼樣溶解后得到的Mn2+近乎無色，不能直接進行光度測定，采用氧化還原法顯色，如用過硫酸鹽將Mn2+氧化成MnO4-：2Mn2+5S2O82-+8H2O=2MnO4-+10SO42-+16H+即可在525nm處進行測定。（2）顯色劑無機顯色劑與金屬離子形成的配合物在穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性方面較差，一般較少使用。目前仍有一定實用價值的無機顯色劑僅有硫氰酸鹽、鉬酸銨、過

22、氧化氫等幾種。更實用的是有機顯色劑，它能與金屬離子形成穩(wěn)定配合物，具有較高的靈敏度和選擇性。有機顯色劑及其產物的顏色與其分子結構有密切關系。分子中若含有一個或一個以上某些不飽和基團（共軛體系）的有機化合物，往往是有顏色的，這些基團稱為發(fā)色團（或生色團），如偶氮基（-N=N-）、醌基（）、亞硝基（-N=O）、硫碳基（）等。另外，有些含孤對電子的基團，如-NH2、-NR2、-OR、-OH 、-SH、-Cl、-Br等，雖本身沒有顏色，但它們的存在卻會影響有機試劑及其與金屬離子的反應產物的顏色，這些基團稱為助色團。有機顯色劑一般含有多個生色團和助色團，當金屬離子與有機試劑形成配合物時，由于助色團的影響

23、，通常會發(fā)生電荷轉移躍遷和配合物內電子躍遷，使產物的最大吸收波長紅移，顏色加深，產生很強的紫外-可見吸收光譜。有機顯色劑的種類繁多，其結構及具體應用可參見有關書籍。（3）顯色反應條件的選擇顯色反應往往會受顯色劑的用量、體系的酸度、顯色反應溫度、顯色反應時間等因素影響。合適的顯色反應條件一般是通過實驗來確定的。 （3.1）顯色劑用量為保證顯色反應進行完全，需加入過量顯色劑，但也不能過量太多，因為過量顯色劑的存在有時會導致副反應發(fā)生，從而影響測定。確定顯色劑用量的具體方法是：保持其他條件不變僅改變顯色劑用量，分別測定其吸光度，以顯色劑濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制A-cR曲線，可得圖10-8

24、所示的幾種情況。圖中（a）是顯色劑用量達到一定量后吸光度變化不大，顯色劑用量可選范圍（圖中XY段）較寬；（b）與（a）不同的是顯色劑過多會使吸光度變小，只能選擇吸光度大且平坦的范圍（X/Y/段）；（c）的吸光度隨顯色劑用量的增加而增大，這可能是由于生成顏色不同的多級配合物造成的，這種情況下必須非常嚴格地控制顯色劑的用量。圖10-8 吸光度與顯色劑用量關系曲線（3.2）反應體系的酸度圖10-9吸光度與pH的關系曲線酸度對顯色反應的影響是多方面的。許多顯色劑本身就是有機弱酸（堿），酸度變化會影響它們的解離平衡和顯色反應能否進行完全；另外酸度降低可能使金屬離子形成各種形式的羥基配合物乃至沉淀；某些逐

25、級配合物的組成可能隨酸度而改變，如Fe3+與磺基水楊酸的顯色反應，當pH為23時，生成組成為1:1的紫紅色配合物；當pH為47時，生成組成為1:2的橙紅色配合物；當pH為810時，生成組成為1:3的黃色配合物。一般確定適宜酸度的具體方法是在相同實驗條件下，分別測定不同pH條件下顯色溶液的吸光度。通?？梢缘玫饺鐖D10-9所示的吸光度與pH的關系曲線。適宜酸度可在吸光度較大且恒定的平坦區(qū)域所對應的pH范圍中選擇?？刂迫芤核岫鹊挠行мk法是加入適宜的pH緩沖溶液，但同時應考慮由此可能引起的干擾。 （3.3）顯色反應的溫度多數顯色反應在室溫下即可很快進行，但有些顯色反應需在較高溫度下才能較快完成。這種情

26、況下需注意升高溫度帶來的有色化合物熱分解問題。適宜的溫度也是通過實驗確定的。 （3.4）顯色反應的時間時間對顯色反應的影響需從以下兩方面綜合考慮。一方面要保證足夠的時間使顯色反應進行完全，對于反應速率較小的顯色反應，需顯色時間長些。另一方面測定工作必須在有色配合物的穩(wěn)定時間內完成。適宜的顯色時間同樣需通過實驗做出顯色溫度下的吸光度-時間曲線來確定。（3.5）溶劑由于溶質與溶劑分子的相互作用對可見吸收光譜有影響，因此在選擇顯色反應條件的同時需選擇合適的溶劑。一般盡量采用水相測定。如果水相測定不能滿足測定要求（如靈敏度差、干擾無法消除等），則應考慮使用有機溶劑。如Co(NCS)42-在水溶液中大部

27、分解離，加入等體積的丙酮后，因水的介電常數減小而降低了配合物的解離度，溶液顯示配合物的天藍色，可用于鈷的測定。對于大多數不溶于水的有機物的測定，常使用脂肪烴、甲醇、乙醇和乙醚等有機溶劑。（3.6）共存離子的干擾及消除若共存離子有色，或與顯色劑形成的配合物有色將干擾待測組分的測定。通常采用下列方法消除干擾。加入掩蔽劑。如光度法測定Ti4+，可加入H3PO4作掩蔽劑，使共存的Fe3+（黃色）生成無色的Fe(PO4)23-，消除干擾。又如用鉻天菁S光度法測定Al3+，加抗壞血酸作掩蔽劑將Fe3+還原為Fe2+，從而消除Fe3+的干擾。掩蔽劑的選擇原則是：掩蔽劑不與待測組分反應；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干

28、擾組分的反應產物不干擾待測組分的測定。選擇適當的顯色條件，如酸度等以避免干擾。分離干擾離子。在不能掩蔽的情況下，一般可采用沉淀、有機溶劑萃取、離子交換和蒸餾揮發(fā)等分離方法除去干擾離子，其中以有機溶劑萃取在分光光度法中應用最多。另外，選擇適當的光度測量條件（如合適的波長與參比溶液等）也能在一定程度上消除干擾離子的影響。10.2.3 吸光度測量條件的選擇 光度法測定中，除了需從試樣角度選擇合適的顯色反應和顯色條件等，還需從儀器角度選擇較佳的測定條件，以盡量保證測定結果的準確度。（1）入射光波長的選擇吸光度A圖10-10 吸收曲線a 鈷配合物的吸收曲線； b 1-亞硝基-2-萘酚-3，6磺酸顯色劑的

29、吸收曲線波長在最大吸收波長max處不僅能獲得高靈敏度，而且還能減少由非單色光引起的對朗伯-比耳定律的偏離。因此，在光度法測定中一般選擇max作入射波長。但若在max處有共存離子干擾，則可考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。如圖10-10所示，1-亞硝基-2-萘酚-3，6磺酸顯色劑及其鈷配合物在420nm處均有最大吸收，如在此波長測定鈷，則未反應的顯色劑會發(fā)生干擾而降低測定的準確度。因此，必須選擇在500nm處測定，在此波長下顯色劑無吸收，而鈷配合物則有一吸收平臺。用此波長測定，靈敏度雖有所下降，但可以消除干擾，提高測定的準確度和選擇性。有時為測定高濃度組分，也選用靈敏度稍低的吸收波長作

30、為入射波長，保證標準曲線有足夠的線性范圍。（2）參比溶液的選擇在吸光度測定中，將發(fā)生反射、吸收和透射等作用，由于溶液的某種不均勻性所引起的散射以及溶劑、試劑（如顯色劑、緩沖溶液、掩蔽劑等）對光的吸收，會導致透射光強度的減弱，為使光強度減弱僅與溶液中待測物質的濃度有關，單波長分光光度計采用參比溶液進行校正。即在相同的吸收池中裝入參比溶液，調節(jié)儀器使吸光度為零（稱工作零點），待測溶液的吸光度，實質是以通過參比皿的光強度為入射光強度，這樣測得的吸光度才能真實地反映待測物質對光的吸收。參比溶液的選擇一般為： 若僅待測組分與顯色劑的反應產物在測定波長處有吸收，而被測試液、顯色劑及其他試劑均無吸收，則可用

31、純溶劑作參比溶液。 若顯色劑或其他試劑在測定波長處略有吸收，而試液本身無吸收，則可用“試劑空白”（不加被測試樣的試劑溶液）作參比溶液。 若待測試液本身在測定波長處有吸收，而顯色劑等無吸收，可用“試樣空白”（不加顯色劑的被測試液）作參比溶液。 若顯色劑、試液中其他組分在測定波長處有吸收，則可在試液中加入適當掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑作為參比溶液。（3）吸光度讀數范圍的選擇對于給定的分光光度計，其透光度讀數誤差T是一定的（一般為0.2%2%）。但由于透光度與濃度的非線性關系，在不同的透光度讀數范圍內，同樣大小的讀數誤差T所產生的濃度誤差c是不同的。根據朗伯比耳定律 即 將上式微分 兩式相除得

32、 以有限值表示可得 (10-6)式中表示濃度測量值的相對誤差。式（10-6）表明，濃度的相對誤差不僅與儀器的透光度讀數誤差T有關，而且與其透光度T的值有關。假設儀器的T =0.5%，則可繪出溶液濃度相對誤差（只考慮正值時）與其透光度T的關系曲線，如圖10-11所示。圖10-11 c/c T關系曲線（T =0.5%）用數學上求極值的方法可求出濃度相對誤差最小值。T =0.5%時，濃度測量的相對誤差（只考慮正值時）最小值為1.4%，相應的透光度Tmin=0.368，吸光度Amin=0.434。由圖可見，濃度的相對誤差與透光度讀數有關。當T =0.5%時，T落在10%70%（吸光度讀數A在1.00.

33、15）范圍內，濃度測量的相對誤差較小，約為1.4%2.2%。光度測量時，吸光度讀數過高或過低，濃度測量的相對誤差都將增大。因此，普通分光光度法不適用于高含量或極低含量組分的測定。在上述討論中，我們假定透光度的絕對誤差T與透光度值無關，T是由儀器刻度讀數所引起的誤差。實際上由于儀器設計及制造水平不同，T可能不同。影響透光度測量誤差的因素很多，難以找到誤差函數的準確表達式，實際工作中應參照儀器說明書，具體問題具體分析，創(chuàng)造條件使測定值在適宜的吸光度范圍內進行。通常采取的措施還有控制待測溶液的濃度（如濃溶液稀釋）和選擇合適厚度的吸收池。 （4）提高光度測定靈敏度和選擇性的途徑雖然光度法本身靈敏度較高

34、，但是對一些痕量組分的測定還需提高靈敏度。另外，許多顯色反應的選擇性不高，故測定復雜組分試樣受到限制。提高測定的靈敏度和選擇性可以采用多種途徑，如合成新的高靈敏度有機顯色劑，采用多元配合物顯色體系，采用分離富集和測定相結合。讀者可參閱有關書刊。10.3 可見光分光光度法的應用 分光光度法主要用于微量組分含量的測定，也可以用于高含量組分的測定、多組分分析，以及研究化學平衡和配合物組成的測定。10.3.1高含量組分的測定示差法光度法廣泛應用于微量組分的測定，對于常量或高含量組分的測定無能為力，這是因為當待測組分濃度高時會偏離朗伯-比耳定律，也會因測得的吸光度值超出適宜的讀數范圍產生較大的測量誤差。

35、若采用示差分光光度法（簡稱示差法），則能較好地解決這一問題。示差法與普通光度法的主要區(qū)別在于它們所采用的參比溶液不同。示差法采用一適當濃度（接近試樣濃度）的標準溶液作參比進行測量。設待測溶液的濃度為cx，標準溶液濃度為cs（cscx）。示差法測定時，首先用標準溶液cs作參比調節(jié)儀器透光度T為100%（A=0）。然后測定待測溶液的吸光度，該吸光度為相對吸光度A，根據朗伯-比耳定律有：Ax=ebcx As=ebcs A= Ax- As =ebcx -ebcs=ebc (10-7)圖10-12 示差法標尺擴展原理上式表明示差法所測得的吸光度實際上相當于普通光度法中待測溶液與標準溶液吸光度之差A，A與

36、待測溶液與標準溶液的濃度差c呈線性（正比）關系。若用cs為參比，測定一系列c已知的標準溶液的相對吸光度A，以A為縱坐標，c為橫坐標，繪制A-c工作曲線，即示差法的標準曲線。再由測得的待測溶液的相對吸光度A，即可從標準曲線上查得相應的c，根據cx=cs+c計算得出待測溶液的濃度cx。圖10-13 不同濃度的標準溶液作參比時的誤差曲線示差法的標尺擴展原理以圖10-12為例進行說明。設普通光度法中，濃度為cs的標準溶液的透光度Ts為10%，而示差法中該標準溶液作為參比溶液，其透光度調至Tr=100%（A=0），這相當于將儀器透光度標尺擴大了10倍。若待測溶液cx在普通光度法中的透光度為Tx=5%，則

37、示差法中將是Tr=50%，此讀數落在透光度的適宜范圍內，從而提高了c測量的準確度。 圖10-13中b、c、d是不同Ts的溶液作參比時的誤差曲線（假定T=0.5%）。由圖可見隨著參比溶液濃度的增加（Ts減?。?，濃度相對誤差也減小。若參比溶液選擇適當，即待測溶液濃度與參比溶液的濃度差小，示差法的準確度高，可接近于滴定分析法的準確度。應用示差法時，要求儀器光源有足夠的發(fā)射強度或能增大光電流的放大倍數，以便能調節(jié)示差法所用參比溶液的透光度為100%。因此，示差法要求儀器具有質量較高的單色器和足夠穩(wěn)定的電子系統。10.3.2 多組分分析應用分光光度法還可以對同一溶液中的不同組分直接進行測定，而不需預先分

38、離，從而大大減少分析操作步驟，避免在分離過程中造成誤差。此法對含量較低的組分效果更好。假定溶液中存在兩種組分x和y，它們的吸收光譜一般有以下兩種情況。若吸收光譜不重疊或至少可能找到某一波長時x有吸收而y不吸收，在另一波長下y有吸收而x不吸收，如圖10-14所示，則可在不同波長下分別測定組分x和y。若吸收光譜重疊較嚴重，如圖10-15所示，從圖中可以看出，在波長1和波長2下x和y兩組分的吸光度差A較大，分別在波長1和2下測得混合試液的吸光度A1和A2，由吸光度值的加和性可得聯立方程： 式中cx和cy分別為組分x和y的物質的量濃度； ex1和ey1分別為組分x和y在波長1時的摩爾吸光系數；ex2和ey2分別為組分x和y在波長2時的摩爾吸光系數。圖10-14 吸收光譜不重疊圖10-15 吸收光譜重疊摩爾吸光系數可以分別由x、y的純溶液在兩種波長下測得。解聯立方程組即可求出cx和cy的值。原則上對任何數目的混合組分都