微小RNA及其在惡性淋巴增殖性疾病中作用的研究進展

1、微小RNA及其在惡性淋巴增殖性疾病中作用的研究進展     【摘要】  在動植物基因組中廣泛存在一類非編碼蛋白的RNA 基因，產(chǎn)生長度大約為19-25 個核苷酸的RNA，它們被命名為微小RNA （microRNA，miRNA）。這是一類具有調(diào)節(jié)其他基因表達活性的小RNA。在生物的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。本文對這類基因的特征、生物學(xué)功能、產(chǎn)生與作用機制和在惡性淋巴增殖性疾病中作用的研究進展作一綜述。 【關(guān)鍵詞】  miRNA；非編碼RNA；惡性淋巴增殖性疾病Progress on the Research of MicroRNA an

2、d Its Functions in Lymphoid MalignanciesReviewAbstract   Plant and animal genomes contain an abundance of small genes that produce RNAs of about 22 nucleotides in length，which was dubbed as microRNA （miRNA). These newly found endogenous RNAs may participate in a wide range of genetic regul

3、atory pathways and play an important role in the organism development . This paper  reviewed  the recent studies and progress on the characteristics，functions and mechanisms of the microRNAs，as well as the advances of research on lymphoid malignancies.Key words  miRNA; non-coding RNA

4、; lymphoid malignancies很多年來，DNA和蛋白質(zhì)一直是基因組研究中的主角，而RNA只是被看作來往于DNA和蛋白質(zhì)間的信使而已。最近，越來越多的證據(jù)已清楚地表明，RNA在幾乎所有動植物物種中扮演的角色遠比我們早先料想的活躍。真核生物中存在兩種主要的非編碼RNA（non-coding RNA），并發(fā)揮著重要的作用。一類為小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），另一為微小RNA（microRNA，miRNA）。miRNA是一種大小19-25 nt的單鏈小分子RNA，最早被確認的miRNA是在線蟲中的lin-4 （1993年）1和let-7（200

5、0年）2，3，它們參與調(diào)控線蟲的發(fā)育時序（development timing），由于它們的長度很短而且作用時間短暫，所以lin-4 和let-7一開始被稱為時間小RNA （small temporal RNA，stRNA）。后來隨著大量的miRNA被發(fā)現(xiàn)，對這些小分子RNA 的基因序列、加工表達方式、生理功能等方面研究表明，miRNA發(fā)揮著非常重要的、基因表達的調(diào)節(jié)作用，從一個全新的角度來認識基因及其表達調(diào)節(jié)的本質(zhì)。2002 年美國科學(xué)雜志評出的年度十大科技突破中，miRNA 的發(fā)現(xiàn)名列榜首。到目前為止已報道了在人類、果蠅、植物等多種生物物種中有將近1400個miRNA被報道?，F(xiàn)在除了lin

6、-4 和let-7 外，其他miRNA統(tǒng)一用miR-#（#代表數(shù)字）表示，而相應(yīng)的編碼基因則用mir-#（#代表數(shù)字）表示。本文就miRNA特征和功能的研究進展以及與惡性淋巴增殖性疾病的關(guān)系作一綜述。微小RNA的特征miRNA廣泛存在于真核生物中，與其他寡核苷酸相比，主要有以下特征。    （1）一般來源于染色體非編碼蛋白區(qū)的一段，本身不具有開放讀框 （ORF） 及蛋白質(zhì)編碼基因的特點，現(xiàn)已鑒定的miRNA沒有一個與已知的表達序列標簽（EST）匹配，說明它們是由不同于mRNA的特殊轉(zhuǎn)錄單元表達的4。    （2）成熟的miRNA長度一

7、般為19-25 nt，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90 nt的單鏈RNA前體經(jīng)過切酶（RNA）Dicer酶加工后生成5，它們可以和上游或下游的序列不完全配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)參與了成熟miRNA的加工。    （3）成熟的miRNA 5 端有一磷酸基團，3 端為羥基，定位于RNA前體的3 端或者5 端，且具有獨特的序列特征。其5端第一個堿基對U有強烈的傾向性，而對G卻有抗性，但第2-4個堿基缺乏U，一般來講，除第4個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。    （4）miRNA基因不是隨機排列的，其中有一些成簇存在。多個miRNA

8、基因共同轉(zhuǎn)錄成一個前體RNA，然后成熟的miRNA從這個前體上加工而來6。來自同一個基因簇中的miRNA具有較強的同源性，而不同基因簇中的miRNA同源性較弱。例如線蟲中一組高度相關(guān)的miRNA基因mir-35-mir-41，集中簇生在2號染色體的1 kb片段上，共同轉(zhuǎn)錄成1個前體miRNA，然后加工形成7個成熟的miRNA，在胚胎和成蟲早期均高度表達，而在其他發(fā)育階段不表達。    （5）多數(shù)miRNA 的基因結(jié)構(gòu)和功能在進化中呈現(xiàn)保守性，各種miRNA都能在其他種系中找到同源體。約12%的miRNA在線蟲、果蠅、哺乳動物和植物中呈現(xiàn)保守性，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，這些

9、保守片段中的堿基差異僅為1-2 nt。其中miR-1、miR-34、miR-87在非脊椎動物和脊椎動物中高度保守。對miRNA的表達和進化保守性的解釋是：為數(shù)眾多的miRNA構(gòu)成了調(diào)節(jié)性RNA家族，通過與mRNA內(nèi)的特定靶序列互補配對，參與這些基因的表達調(diào)控7。    （6）miRNA的表達具有階段特異性和組織特異性，即在生物發(fā)育的不同階段里有不同的miRNA表達，在不同組織中表達不同類型的miRNA8。大多數(shù)miRNA的表達具有時序性，miR-3、miR-7基因只在果蠅胚胎形成時表達，而miR-1、miR-12的含量在果蠅幼蟲階段急劇上升，并在成蟲期維持較高水平

10、，同時在所有階段都存在的miR-9和miR-11的含量卻急劇減少9。小鼠胚胎中miR-1也呈階段性表達，只在胚胎形成的階段可以探測到其存在。miRNA的表達具有細胞和組織特異性，Bartel等10發(fā)現(xiàn)在已經(jīng)鑒定的16個miRNA中，有15個只在特定的植物組織中高水平表達。miR-1在人類和成年鼠心肌組織中特異性表達，在其他組織中檢測不到；miR-17、miR-20位于HeLa細胞同一基因簇內(nèi)，并在斑馬魚細胞中表達，但在鼠腎和蛙卵巢細胞中未檢測到；miR-1和let-7都在成年果蠅中表達，而不在20-24小時的胚胎細胞中表達，在HeLa細胞中卻只測到let-7 miRNA。在不同的細胞和組織中不

11、同的發(fā)育時間中差異表達，顯示了它們在控制個體發(fā)育中的特定功能。微小RNA的功能目前只有極少的miRNA功能被初步闡明，絕大部分miRNA的功能（特別是在哺乳動物中）還不清楚。miRNA在生物的整個發(fā)育過程中可能有以下重要的功能。個體發(fā)育的調(diào)控  在線蟲的發(fā)育過程中l(wèi)in-4和let-7呈生長階段的特異性表達，通過對mRNA序列特異的反義抑制，對線蟲幼蟲不同發(fā)育階段的過渡進行調(diào)控。lin-4控制幼體早期發(fā)育階段（幼蟲1期到幼蟲2期）的細胞分化，而let-7控制幼蟲4期以后的階段到成體的轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)發(fā)育進展。Gary等11曾報道缺乏或過度表達lin-4和let-7都會引起異時表型（異時是指

12、祖先和后代種類在發(fā)育事件相應(yīng)時間上互不相同的情況），即改變了發(fā)育過程中速度調(diào)控的過程。在植物miRNA的研究中，發(fā)現(xiàn)植物心皮工廠（carpel factory，car）突變株中3個miRNA的表達水平顯著下降。植物心皮工廠是一個類似切酶的酶，參與植物的發(fā)育，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實驗結(jié)果提示，這種缺陷是由于缺少miRNA加工而造成的10。參與細胞分化和組織發(fā)育  lin-4、let-7、mir-14、mir-23和矮腳雞（bantam)基因已被證實在細胞分化和組織發(fā)育中起重要作用12。Chen等13首次闡述了哺乳動物中miRNA的功能，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體使miR-

13、181在鼠科動物的造血祖細胞中異常地表達，然后用不同的條件處理這些細胞，分析B淋巴細胞和T淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞量加倍，而T淋巴細胞不受影響。這暗示miRNA可能在鼠類和人的細胞發(fā)育分化中起著關(guān)鍵的作用。雙側(cè)不對稱性（bilateral asymmetry）是很多生物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的正?，F(xiàn)象，然而對這種機制現(xiàn)在了解得還很少。Johnston等14發(fā)現(xiàn)，在線蟲神經(jīng)細胞中有一種miRNA（此種miRNA的基因被稱為lsy-6）控制著左/右神經(jīng)細胞的不對稱基因表達（cog-1是1sy-6 miRNA 靶基因），這可部分解釋神經(jīng)系統(tǒng)功能的非對稱性。調(diào)控基因的表達  人類基因中有超過20

14、%的基因是由被miRNA所調(diào)節(jié)的15，一些miRNA通過調(diào)節(jié)下調(diào)靶mRNA的表達16。對lin-4和let-7的研究表明，miRNA的主要功能是進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（posttranscriptional regulation）。miRNA可以通過兩種機制中的一種調(diào)節(jié)靶基因的表達，其中之一是結(jié)合到靶mRNA 3 UTR，抑制其翻譯；二是像siRNA作用一樣結(jié)合到靶上并降解靶mRNA17。miRNA可以作為觸發(fā)RNA干擾（RNAi）的分子18參與細胞增殖19、死亡20、細胞凋亡21和脂肪代謝22。miRNA還可能與轉(zhuǎn)座的抑制、基因重組有關(guān)，可能參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達調(diào)控，因此，認為miRNA可

15、能和高等真核生物中調(diào)節(jié)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。miRNA 的加工機制和作用機制加工機制  據(jù)體內(nèi)外實驗研究表明，miRNA的生成至少需要兩個步驟：第一步在細胞核內(nèi)，將長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）加工為70-90 nt的莖環(huán)的二級結(jié)構(gòu)的前miRNA（pre-miRNA），執(zhí)行此過程的酶是RNase 家族中一員Drosha，其作為核心核酸酶執(zhí)行核內(nèi)miRNA前體加工的起始23，24；第二步在細胞質(zhì)中，將莖環(huán)的二級結(jié)構(gòu)前體加工為成熟的miRNA，執(zhí)行此過程的酶為RNase 超家族中另一員切酶（dicer），后者是一種ATP 依賴的核酸內(nèi)切酶。亞細胞定位研究證明，這兩個生物過程

16、分別局限于細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)，因此細胞中一定還存在一轉(zhuǎn)運體系，將pre-miRNA從細胞核運送至細胞質(zhì)。由此可見，miRNA的表達可從上述三個方面進行調(diào)控25。    Pre-miRNA在被dicer/argonaute 復(fù)合物特異性識別，并剪切成22 nt左右的單鏈小RNA，miRNA是pre-miRNA莖中的一個臂。Dicer可以剪切pre-miRNA 5 端的一個臂，也可以剪切3 端的一個臂或者是同時剪切兩個臂7。Dicer及其同源物DCR-1是一類多結(jié)構(gòu)域的RNase III樣蛋白，對雙鏈RNA或莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA進行剪切，產(chǎn)生長度約為22 nt、5 末端為單磷

17、酸基、3 末端為羥基的RNA產(chǎn)物26。作用機制  Ambros17研究發(fā)現(xiàn)lin-4和let-7與靶mRNA的3 UTR部分互補結(jié)合，從而抑制了蛋白質(zhì)的合成。在植物中研究發(fā)現(xiàn)miRNA和靶mRNA完全互補最終導(dǎo)致了靶mRNA的降解12。而在動物中miRNA與靶mRNA通過不嚴格的堿基配對，抑制了mRNA的翻譯27，而此時并不誘導(dǎo)mRNA的降解。然而，有時情況并非完全如此：在動物中，這種堿基是否嚴格配對將決定基因沉默方式，如果miRNA和靶mRNA完全互補它就能進入RNAi途徑并且引導(dǎo)靶mRNA降解而不是抑制翻譯28。在擬南芥（arabidopsis）中即使miR-JAW和其靶序列不完

18、全配對，它也能夠通過降解mRNA來調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子TCP家族的五個成員29，其具體機理目前還不清楚。miRNA與siRNA的聯(lián)系和區(qū)別從miRNA很容易聯(lián)想到另外一種外源性的RNA小分子小干擾RNA（siRNA）。miRNA與siRNA之間存在許多相同之處：在加工方面，siRNA與miRNA從雙鏈前體加工到成熟的22 nt左右的小分子RNA，都是dicer產(chǎn)物，因此具有dicer產(chǎn)物的特點；在功能效應(yīng)方面，二者的生成都需argonaute家族蛋白的存在，同是RISC（RNA interference specificity complex，RISC）的組分，因此在siRNA和miRNA介導(dǎo)的沉默機制上有重疊。    但miRNA在以下幾個方面與siRNA不同：miRNA是細胞內(nèi)RNA的固有組分之一，而siRNA是在RNAi生成過程中形成的中間體，也即siRNA是在病毒感染或人工插入dsRNA后誘導(dǎo)而成的；dicer酶對兩類RNA的加工過程不同，miRNA為不對稱加工，僅來自含莖-環(huán)結(jié)構(gòu)RNA前體的一側(cè)臂，剩余部分很快降解，而siRNA是對稱來源于雙鏈RNA的