聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟

1、聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟-CAL-FENGHAL(2020YEAR-YICAI) JINGBIAN聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟一. 制膠前的準(zhǔn)備 1玻璃板的準(zhǔn)備用洗滌劑將玻璃板反復(fù)擦洗，然后用清水沖洗干凈，待玻璃板晾干后，將1mm塑料薄 片沾少許清水，使其貼在玻璃板上，然后將另一塊凹行玻璃板與原玻璃板緊貼。2. 垂直平板支架的安裝將準(zhǔn)備好的玻璃板，放入垂直支架內(nèi)，兩側(cè)用鋼夾使其固定，鋼夾的高度不要超過凹 行玻璃的凹口處為宜，兩側(cè)選用力度大小適中、對稱的鋼夾。3玻璃板的密封將1 %瓊脂糖用微波爐加熱融化后，倒入支架板底槽中，使其密封即可，然后用吸管吸 取少量瓊脂溶液，沿玻璃板兩邊的縫隙內(nèi)加入，使

2、其密封，待其冷卻凝固后備用。二. 凝膠的制備1 30%的丙烯酰胺溶液的配制(1L)配方：丙烯酰胺(Ac) 290g甲義雙丙烯酰胺(Bis) 10g步驟：稱取樣品，倒入燒杯中用蒸憎水定容至1L 將燒杯置于攪拌器上，使溶液充分溶解至透明將完全溶解的溶液分多次過濾 到棕色容器中保存?zhèn)溆?、lOxTBE溶液的配制(1L)配方:Tris : 108g ;硼酸:55g : EDTANa 2 :步驟：稱取各成分至燒杯用蒸餡水定容至1 L用玻璃棒攪拌至溶劑完全溶解分瓶倒裝待用3、PAGE凝膠的制備(一塊膠為例)配方：30%的丙烯酰胺溶液10ml；10xTBE溶液4ml ;雙蒸水16ml；20%的過硫酸鞍(AP

3、) 200ul；TEMED 溶液 20ul步驟：將各成分稱量好之后混合好以備灌膠4、灌膠把垂直支架傾斜30o ,將配好的PAGE凝膠溶液沿凹形玻璃平口處緩緩倒入至距 平口 7mm處為宜，倒入過程中要避免氣泡的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)有氣泡產(chǎn)生時(shí)，要待氣泡消失后再倒 入。灌膠完成后，用槍吸取少量水密封膠口，壓平膠面。當(dāng)膠面與水之間有一條明顯的界 限時(shí)，表示凝膠已凝固，可以開始點(diǎn)樣電泳。三. 點(diǎn)樣及電泳1 XTBE緩沖溶液的配制量取950ml的蒸憎水，然后加50ml的10XTBE溶液至1000ml處，裝瓶搖勻，備用。2垂直平板電泳槽的安裝將制作好的膠放入垂直電泳槽內(nèi)，凹形玻璃向內(nèi)側(cè)。選擇合適的梳子，輕輕插入玻璃

4、 板內(nèi)，梳子底部與膠面剛好接觸為宜。將插好梳子的玻璃板緊貼電泳槽的硅膠密封圈，用 鋼夾使其固定o 倒入XTBE緩沖洛液于電泳槽內(nèi)，以剛好淹沒凹形玻璃平口為宜。3點(diǎn)樣用微量移液器吸取lul的漠酚藍(lán)溶液，根據(jù)PCR產(chǎn)物量大小吸取適量樣品，點(diǎn)入膠孔內(nèi) 即可。每次加樣前，微量移液器要用蒸鐳水清洗，以避免交義污染。為了確保各 個(gè)膠孔之 間都相互隔離，在點(diǎn)樣之前可先吸取少量的澳酚藍(lán)點(diǎn)入膠孔兩端，看是否有 滲漏現(xiàn)象，如 果有滲漏現(xiàn)象，要重新安裝梳子。每塊膠都要點(diǎn)上maker標(biāo)記。4、電泳點(diǎn)樣結(jié)束后，接通電源，調(diào)節(jié)電圧至300V, 90min,時(shí)間電泳時(shí)間根據(jù)PCR產(chǎn)物分 子量適 當(dāng)延長。1染色液、顯色液的配制染色液：%AgNO3o AgNOsIg加水至1L溶解待用。顯色液：2%NaOHo NaOH 20g加水至1 L溶解待用把電泳完成后的玻璃板取下，小心拔出梳子 揭去凹形玻璃，去掉底部的瓊脂凝膠，小心將膠揭下，放入染色槽中3、染色將膠用蒸憎水沖洗2次，倒入適量的染色液，以淹沒膠體為宜，計(jì)時(shí)Qmin 4顯影染色好的膠體，用蒸懈水