蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)

1、（GB/T 5009.199-2003 蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)酶制劑岳陽(yáng)家政排毒養(yǎng)顏膠囊減肚子她他女鞋痔瘡偏方毛孔大方法一 快速卡法一、目的要求： 學(xué)習(xí)快速卡法測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)殘快速檢驗(yàn)法及熟悉檢驗(yàn)結(jié)果評(píng)定。二、實(shí)驗(yàn)原理：膽堿脂酶可催化靛酚乙酸脂（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍(lán)色） ，有機(jī)磷或氨基甲酸脂 類(lèi)農(nóng)藥對(duì)膽堿脂酶有抑制作用， 使催化、 水解、 變色的過(guò)程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中 是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸脂類(lèi)農(nóng)藥的存在。三、實(shí)驗(yàn)試劑：1、固化有膽堿脂酶和靛酚乙酸脂試紙卡片；2、pH 7.5 磷酸鹽緩沖液：分別稱(chēng)取 15.0g磷酸氫二鈉 Na2HPO4?12H2O與

2、 1.59g無(wú)水磷酸二 氫鉀KH2PO4 ，用 500 mL 蒸餾水溶解。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、整體測(cè)定法（1）選取具有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm 左右方形碎片 ,取 5g 防入帶蓋瓶中，加入 10 mL 緩沖溶液，振搖 50 次，靜置 2min 以上 .（2）取一片快速卡， 用白色藥片沾取提取液， 放置 10min 以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)， 有條件時(shí)在 37 恒溫裝置中放置 10min 。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn)。（3）將快速卡對(duì)折，用手捏 3min 或用恒溫裝置恒溫 3min ，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā) 生反應(yīng)。注意： 每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對(duì)照。2、表面測(cè)定法（粗篩法）

3、（1）擦去蔬菜表面泥土，滴 23 滴緩沖液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。（2）取一速片測(cè)卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。（3）放置 10 min 以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)， 有條件時(shí)在 37 恒溫裝置中放置 10 min 。預(yù)反應(yīng) 10 min ， 預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn)。（4）將快速卡對(duì)折，用手捏 3min 或用恒溫裝置恒溫 3min ，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā) 生反應(yīng)。注意： 每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對(duì)照。五、檢測(cè)結(jié)果判斷：1、結(jié)果判斷結(jié)果以酶被有機(jī)磷或氨基甲酸脂類(lèi)農(nóng)藥抑制（為陽(yáng)性） 、未抑制（陰性）表示。 與空白對(duì)照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍(lán)色均為陽(yáng)性結(jié)果。白色藥

4、片變?yōu)樘焖{(lán) 色或與空白對(duì)照卡相同，為陰性結(jié)果。對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的樣品，可用其他方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。2、樣品檢測(cè)結(jié)果記錄并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。六、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)及說(shuō)明：1、速測(cè)卡靈敏度指標(biāo)如下表所示。部分農(nóng)藥檢出限參考表農(nóng)藥名檢出限農(nóng)藥檢出限農(nóng)藥檢出限稱(chēng)（ mg/kg ）名稱(chēng)（mg/kg）名稱(chēng)（mg/kg）甲氨磷1.7乙酸甲胺磷3.5久效磷2.5對(duì)硫磷1.7敵敵畏0.3甲萘盛25水胺硫磷3.1敵百蟲(chóng)0.3好年冬1.0馬拉硫 磷2.0樂(lè)果1.3呋喃丹0.5氧化樂(lè)果2.32、速測(cè)卡法符合率： 在檢出的 30 份以上陽(yáng)性樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗(yàn)證，陽(yáng)性結(jié)果的符合 率應(yīng)在 80%以上。3、蔥、蒜、蘿

5、卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有對(duì)酶有影響的植物次生物 質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，處理樣品時(shí)，可采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測(cè)定法。對(duì)一些 含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提法，減少色素的干擾。4、當(dāng)溫度條件低于 37，酶反應(yīng)速度隨之放慢， 藥片加液后放置反應(yīng)的時(shí)間也應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng)， 延長(zhǎng)時(shí)間的確定，應(yīng)以空白對(duì)照卡用手指（體溫）捏 3min 時(shí)可以變藍(lán)，即可往下操作。注 意樣品放置的時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照卡放置的時(shí)間一致才有可比性?？瞻讓?duì)照卡不變色的原因： 一是藥片表面緩沖溶液加得少、預(yù)反應(yīng)后的藥片表面不夠濕潤(rùn)；二是溫度太低。5、紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)的時(shí)間以3min 為準(zhǔn)，

6、3 min 后的藍(lán)色會(huì)逐漸加深， 24h 后顏色回逐漸退去。方法二 酶抑制率法（分光光度法）、目的要求： 學(xué)習(xí)酶抑制率法測(cè)定果蔬有機(jī)磷和氨基甲酸脂類(lèi)農(nóng)藥殘留的原理和方法， 注 意實(shí)驗(yàn)過(guò)程的操作要點(diǎn)。、實(shí)驗(yàn)原理：根據(jù)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥能抑制乙酰膽堿酯酶的活性原理， 向蔬菜的提取液 中加入生化反應(yīng)底物碘化乙酰硫代膽堿和乙酰膽堿酯酶， 如果蔬菜不含有機(jī)磷或氨基甲酸酯 類(lèi)農(nóng)藥殘留或殘留量低， 酶的活性就不被抑制， 實(shí)驗(yàn)中加入的底物就能被酶水解， 水解產(chǎn)物 與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)。 如果蔬菜的提取液含有農(nóng)藥并殘留量較高時(shí)， 酶的活性 被抑制，底物就不被水解， 當(dāng)加入顯色劑時(shí)就不顯色或顏色變

7、化很小。 用分光光度計(jì)在 412nm 處或農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀測(cè)定吸光值， 根據(jù)計(jì)算出的抑制率， 就可以判斷蔬菜中含有機(jī)磷或 氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的情況。三、實(shí)驗(yàn)試劑和儀器：（一）試劑1、pH8.0 緩沖液 分別稱(chēng)取 11.9g無(wú)水磷酸氫二鉀與 3.2g 磷酸二氫鉀，溶解于 1000 mL 蒸 餾水中。2、乙酰膽堿酯酶（實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用酶）根據(jù)酶活力用緩沖溶液溶解，3 min 的吸光值變化 A 0值應(yīng)控制在 0.3 以上。搖勻后在 05冰箱中保存，保存期不超過(guò) 4 天。3、底物碘化乙酰硫代膽堿稱(chēng)取 25.0 mg 碘化乙酰硫代膽堿，用3.0 mL 緩沖溶液溶解，在05下保存。保存期不超過(guò) 2 周。4、

8、顯色劑 分別稱(chēng)取 160 mg 二硫代二硝基苯甲酸和 15.6 mg 碳酸氫鈉， 用 20 mL 緩沖溶液 溶解， 4冰箱保存。5、可選用由以上試劑配置的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的A0值應(yīng)控制在 0.3 以上。（二）儀器1、分光光度計(jì)或相應(yīng)的農(nóng)殘快速檢測(cè)儀；2、天平（ 0.01g）； 3、恒溫水浴或恒溫培養(yǎng)箱。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、樣品處理 選取有代表性的蔬菜樣品，去掉不可食部分后稱(chēng)取蔬菜試樣，沖洗掉表面泥土，剪成 1 cm 左右碎片。取樣品 1 g ，放入燒杯或提取瓶中，加入 5 mL 緩沖液，振蕩 12 min ，倒出 提取液，靜置 35 min ，待用。2、對(duì)照溶液測(cè)試先于試管中加入 2.5 m

9、L 緩沖液，再加入 0.1 mL 酶液、 0.1 mL 顯色劑。搖勻后于 37 放置 15 min 以上（每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致） 。加入 0.1 mL 低物搖勻，此時(shí)檢液開(kāi)始顯 色反應(yīng)，應(yīng)立即放入比色皿中，記錄反應(yīng)3 min 的吸光度的變化值 A 0。3、樣品溶液測(cè)定先于試管中加入 2.5 mL 樣品提取液，其他操作與對(duì)照測(cè)定相同，記錄反應(yīng) 3 min 的吸 光度的變化值 At。五、結(jié)果計(jì)算：A0At抑制率（ %） = 0 t 100A0式中 A 0對(duì)照液反應(yīng) 3 min 吸光度的變化值； At 樣品溶液反應(yīng) 3 min 吸光度的變化值。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷： 當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率大于

10、 50% 時(shí)，表示樣品中有高劑量的有機(jī)磷或氨基甲 酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留，可判定樣品為陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性的樣品需重復(fù)檢驗(yàn)兩次以上。 檢驗(yàn)結(jié)果記錄：樣品名稱(chēng) A0At抑制率（ %）檢驗(yàn)結(jié)果七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)及說(shuō)明1、對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性的樣品，需用其他方法進(jìn)一步確定殘留農(nóng)藥的種類(lèi)和進(jìn)行定量測(cè)定。2、酶抑制率法對(duì)部分農(nóng)藥的檢出限為：農(nóng)藥名稱(chēng)檢出限（ mg/kg ）農(nóng)藥名稱(chēng)檢出限（ mg/kg ）敵敵畏0.1氧化樂(lè)果0.8對(duì)硫磷1.0甲基異柳磷5.0辛硫磷0.3滅多威0.1甲胺硫2.0丁硫克百威0.05馬拉硫磷4.0敵百蟲(chóng)0.2樂(lè)果3.0呋喃丹0.053、蔥、蒜、蘿卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，處理樣品時(shí)，可采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測(cè)定法。對(duì)一些 含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提法，減少色素的干擾。4、當(dāng)溫度條件低于 37，酶反應(yīng)速度隨之放慢， 藥片加液后放置反應(yīng)的時(shí)間也應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng)， 延長(zhǎng)時(shí)間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對(duì)照測(cè)試的吸光度變化A0在 0.3 以上為準(zhǔn)。注意樣品放置時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照溶液