液相基礎(chǔ)知識

1、HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC的環(huán)境設(shè)置：HPLC Business DeptShimadzu Corporation一、色譜起源一、色譜起源石油石油醚醚碳酸碳酸鈣顆鈣顆粒粒色素色素色色譜譜組組分分HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色譜流程圖輸輸液液泵泵進(jìn)樣進(jìn)樣器器色色譜

2、譜柱柱柱溫箱柱溫箱檢測檢測器器溶溶劑劑數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)處處理理HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLCHPLC的分離類型的分離類型HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu Corporation正相正相HPLC HPLC 色色譜譜柱柱Silica gelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)Modified SiHPLC Business DeptShimadzu Corporatio

3、n反相反相HPLC HPLC 色色譜譜柱柱-Si-C18H37SiHPLC Business DeptShimadzu Corporation流動相流動相選擇注意事項：流動相選擇注意事項：純度：采用純度：采用“ “ HPLC ” ”級溶劑級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑劑對試樣有適宜的溶解度對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小溶劑粘度要小與檢測器相匹配與檢測器相匹配流動相配制時的順序流動相配制時的順序HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶溶 劑劑 等等 級級水的等級水的等級純化水純化水蒸餾水蒸餾水去離子

4、水去離子水波長波長 (nm)純化水純化水去離子水去離子水因為不純物的存在，去離子的吸光率較高因為不純物的存在，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC用水可以通過以下幾個方面來得到：HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu Corporation溶劑前處理 過濾：過濾：0.45um0.45um或更小孔徑濾膜或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜目的：除去溶劑中的微小

5、顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。HPLC Business DeptShimadzu Corporation30mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過濾，由0.22m和0.45m兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.22m和0.45m兩種規(guī)格,材料為纖維素。3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過濾，由0.22m和0.45m兩種規(guī)格。處理樣品體積為7l。樣品過濾頭的類型：樣品過濾頭的類型：HPLC Business DeptShimadzu Corporation濾膜類型濾膜類型：聚四氟乙

6、烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸,70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機(jī)溶劑。HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶劑前處理 脫氣脫氣 目的：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣目的：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡泡 一般混合溶劑中能容納的空氣量往往要比單個一般混合溶劑中能容納的空氣量往往要比單個溶劑所能容納的空氣總量要小溶劑所能容納的空氣

7、總量要小 氣泡對測定的影響：氣泡對測定的影響： 1 1）柱壓波動，流量偏小）柱壓波動，流量偏小 2 2）基線波動）基線波動 返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation柱塞往復(fù)泵單單向向閥閥馬馬達(dá)和凸達(dá)和凸輪輪柱塞桿柱塞桿柱塞桿密封圈柱塞桿密封圈泵頭泵頭10 -100uLHPLC Business DeptShimadzu Corporation島津VP系列輸液泵目的目的 單元單元 流速范圍流速范圍特性和應(yīng)用特性和應(yīng)用 分析分析 LC-10ADLC-10ADVPVP0.001-9.9990.001-9.999無脈動，適于無脈動，適于半微量半微量LC LC 和

8、和 LC-MSLC-MS LC-10ATLC-10ATVPVP0.001-9.9990.001-9.999非凡的耐用性，非凡的耐用性， 適于常量分析適于常量分析*所有單元都既可做高壓梯度又可做低壓梯度所有單元都既可做高壓梯度又可做低壓梯度HPLC Business DeptShimadzu Corporation等度洗脫輸輸液液泵泵進(jìn)樣進(jìn)樣器器色色譜譜柱柱柱溫箱柱溫箱檢測檢測器器HPLC Business DeptShimadzu Corporation梯度洗脫 A 泵泵進(jìn)樣進(jìn)樣器器色色譜譜柱柱柱溫箱柱溫箱檢測檢測器器 B泵泵AB時間時間B 濃濃度度HPLC Business DeptShim

9、adzu CorporationMeOH / H2O = 6 / 4MeOH / H2O = 8 / 2( column : ODS type )等度洗脫HPLC Business DeptShimadzu Corporation95%30%MeOH 濃濃度度梯度洗脫HPLC Business DeptShimadzu Corporation混合器混合器低低壓壓梯度比例梯度比例閥閥 高高壓壓梯度梯度低低壓壓梯度梯度脫氣機(jī)脫氣機(jī)高壓/低壓梯度系統(tǒng)HPLC Business DeptShimadzu Corporation返回高壓梯度系統(tǒng)高壓梯度系統(tǒng)梯度準(zhǔn)確度好梯度準(zhǔn)確度好系統(tǒng)復(fù)雜系統(tǒng)復(fù)雜 ( (

10、需兩臺或三臺泵需兩臺或三臺泵) )低壓梯度系統(tǒng)低壓梯度系統(tǒng)系統(tǒng)簡單系統(tǒng)簡單需在線脫氣機(jī)需在線脫氣機(jī)存在時間滯后效應(yīng)存在時間滯后效應(yīng)高壓/低壓梯度系統(tǒng)HPLC Business DeptShimadzu Corporation進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器手動進(jìn)樣器手動進(jìn)樣器 原理：（原理：（六通閥六通閥） 注入方式：注入方式： 1 1）全量注入全量注入 2 2）部分注入）部分注入返回HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLCHPLC六通閥進(jìn)樣器的使用及保養(yǎng)六通閥進(jìn)樣器的使用及保養(yǎng)HPLC Business DeptShimadzu Corporation工

11、作原理工作原理HPLC Business DeptShimadzu Corporation手動進(jìn)樣器的原理圖手動進(jìn)樣器的原理圖 裝填狀態(tài)裝填狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)返回HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu C

12、orporation進(jìn)樣進(jìn)樣體體積積 檢檢測測器器響響應(yīng)應(yīng)值值定量管體定量管體積積的一半的一半3倍定量管體倍定量管體積積全量注入全量注入部分注入部分注入進(jìn)樣體積與響應(yīng)值關(guān)系進(jìn)樣體積與響應(yīng)值關(guān)系返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation泵的保養(yǎng)HPLC Business DeptShimadzu Corporation色譜柱1 1）柱壓低于）柱壓低于150kgf/cm2（15cm色譜柱）色譜柱）2 2）柱溫在）柱溫在40左右，最高使用溫度為左右，最高使用溫度為503 3）流動相）流動相PH使用范圍為使用范圍為27.5返回ODS柱的使用注意點：柱的使用注意點：

13、HPLC Business DeptShimadzu Corporation柱的保養(yǎng)：HPLC Business DeptShimadzu Corporation流動相注意點流動相注意點HPLC Business DeptShimadzu CorporationLC檢測器檢測器紫外可見檢測器紫外可見檢測器（UV/VIS）二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器（PDA）示差檢測器示差檢測器（RID）電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器（CDD）熒光檢測器熒光檢測器（RF）電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器（L-ECD）質(zhì)譜檢測器質(zhì)譜檢測器（MS）蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD） HPLC Business Dept

14、Shimadzu Corporation反相色譜分析時反相色譜分析時添加添加10-30 mM 三乙胺三乙胺(triethylamine) 可以抑制堿性化合可以抑制堿性化合物色譜峰拖尾物色譜峰拖尾 添加添加1% 醋酸醋酸acetic acid 可以抑制酸性化合物拖尾可以抑制酸性化合物拖尾三乙胺三乙胺(triethylamine) 也用于正相色譜中也用于正相色譜中,使硅膠部分去使硅膠部分去活性活性, 以獲得化合物合適的保留時間以獲得化合物合適的保留時間HPLC Business DeptShimadzu Corporation維護(hù)流程圖吸濾頭吸濾頭單向閥單向閥柱塞密封圈柱塞密封圈線路過濾器線路過濾

15、器檢測器檢測器HPLC Business DeptShimadzu Corporation管線選擇材料不銹鋼 Teflon PEEK (聚醚醚酮)尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.HPLC Business DeptShimadzu Corporation管線材料不銹鋼不銹鋼 ( (可用于所有連接可用于所有連接) )能承受幾千能承受幾千 kg/cm2 壓力壓力酸性或高濃度鹽環(huán)境中易腐蝕酸性或高濃度鹽環(huán)境中易腐蝕 ( (尤其在尤其在pH

16、小于小于2 2時時) )PEEK ( (可用于所有連接可用于所有連接) )能承受高達(dá)能承受高達(dá) 250 kg/cm2壓力壓力可在整個可在整個PH范圍范圍(pH 1-14) )內(nèi)使用內(nèi)使用 不適用于高溶解性溶劑如氯仿等不適用于高溶解性溶劑如氯仿等Teflon ( (用于柱后阻尼管、反應(yīng)管和排液管用于柱后阻尼管、反應(yīng)管和排液管) )化學(xué)惰性大化學(xué)惰性大能承受能承受 5 kgf/cm2 壓力壓力HPLC Business DeptShimadzu Corporation接頭不銹鋼接頭不銹鋼接頭 / / 墊圈墊圈 主要用于輸液泵、進(jìn)樣器的連接主要用于輸液泵、進(jìn)樣器的連接能承受能承受 400 kgf/c

17、m2壓力壓力一旦固定，墊圈不可再動一旦固定，墊圈不可再動PEEK接頭接頭 主要用于色譜柱、檢測器的連接主要用于色譜柱、檢測器的連接易于安裝易于安裝能承受能承受 250 kgf/cm2壓力壓力容易產(chǎn)生死體積容易產(chǎn)生死體積不銹鋼接頭墊圈PEEK接頭HPLC Business DeptShimadzu Corporation吸濾頭材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um10um故障：堵塞故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成措施：用異丙醇（或措施：用異丙醇（或5稀硝酸），超聲波清洗稀硝酸），超聲波清洗，再用蒸餾水清洗，再用蒸餾水清洗HPLC Business De

18、ptShimadzu Corporation單向閥T泵：串聯(lián)式往復(fù)泵泵：串聯(lián)式往復(fù)泵D泵：并聯(lián)式往復(fù)泵泵：并聯(lián)式往復(fù)泵HPLC Business DeptShimadzu Corporation單向閥單向閥結(jié)構(gòu)單向閥結(jié)構(gòu)球座吸液沖程排液沖程出口單向閥進(jìn)口單向閥泵頭拋光面寶石球流動相單向閥原理單向閥原理HPLC Business DeptShimadzu Corporation單向閥清洗故障：寶石球或球座受污導(dǎo)致密封不好故障：寶石球或球座受污導(dǎo)致密封不好表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大措施：措施：打開排液閥，以異丙醇為流動相輸液打開排液閥，以異丙醇為流動相輸液拆下單向閥，放入異丙醇中，超

19、聲波清洗拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波清洗HPLC Business DeptShimadzu Corporation故障故障1 1：寶石球粘附于墊片：寶石球粘附于墊片表現(xiàn)：泵無法吸液或排液，流路不通表現(xiàn)：泵無法吸液或排液，流路不通措施：措施：1 1）用針筒抽出口單向閥以產(chǎn)生負(fù)壓）用針筒抽出口單向閥以產(chǎn)生負(fù)壓，使寶石球與墊片分開，使寶石球與墊片分開 2 2）拆下單向閥，放入異丙醇或水中）拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波清洗，用超聲波清洗單向閥粘結(jié)HPLC Business DeptShimadzu Corporation柱塞密封圈的更換故障：密封圈磨損導(dǎo)致密封不良故障：密封圈磨損導(dǎo)致密

20、封不良現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或漏液現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或漏液措施：更換密封圈措施：更換密封圈注意點：注意點：1 1）更換前，新密封圈用異丙醇）更換前，新密封圈用異丙醇 浸泡浸泡15 min2 2）拆卸泵頭前，柱塞桿復(fù)位）拆卸泵頭前，柱塞桿復(fù)位 （P PSETSET）流動相泵頭清洗管路柱塞桿密封圈HPLC Business DeptShimadzu Corporation線路過濾器故障：堵塞故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓力現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓力 偏高偏高措施：異丙醇（或措施：異丙醇（或5 5稀硝酸），稀硝酸）， 超聲波清洗超聲波清洗判斷依據(jù)判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出：關(guān)閉排液閥，斷開出口

21、管路，設(shè)定流速口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力如壓力5kgf/cm2，則堵塞。，則堵塞。排液閥壓力傳感器線路過濾器流動相HPLC Business DeptShimadzu Corporation 手動進(jìn)樣器操作注意點：操作注意點：1 1）進(jìn)樣時，進(jìn)樣針應(yīng)插到底）進(jìn)樣時，進(jìn)樣針應(yīng)插到底2 2）不使用時將針頭留在進(jìn)樣器內(nèi)）不使用時將針頭留在進(jìn)樣器內(nèi)3 3）進(jìn)樣應(yīng)使用液相色譜專用平頭）進(jìn)樣應(yīng)使用液相色譜專用平頭 進(jìn)樣針進(jìn)樣針4 4）樣品溶液）樣品溶液pH小于小于10, 常用密封常用密封墊的材質(zhì)適用墊的材質(zhì)適用pH10, 否則換特否則換特氟隆材質(zhì)的密封墊氟隆材質(zhì)的密封墊pH10-135 5）清

22、洗應(yīng)使用專用針口清洗器）清洗應(yīng)使用專用針口清洗器定子轉(zhuǎn)子針頭密封墊彈簧不銹鋼套HPLC Business DeptShimadzu Corporation清洗針口HPLC Business DeptShimadzu Corporation色譜柱柱效降低原因濾片或填料濾片或填料堵塞堵塞樣品或流動相中樣品或流動相中雜質(zhì)吸附雜質(zhì)吸附機(jī)械振動機(jī)械振動產(chǎn)生空隙產(chǎn)生空隙填料變性填料變性HPLC Business DeptShimadzu Corporation濾片或填料堵塞使用預(yù)柱使用預(yù)柱緩沖液和溶劑使用緩沖液和溶劑使用0.45um濾膜過濾濾膜過濾樣品溶液使用樣品溶液使用0.45um濾膜過濾濾膜過濾反向連

23、接色譜柱，使用清洗溶劑以小流量送液反向連接色譜柱，使用清洗溶劑以小流量送液打開柱頭，清洗或更換濾片打開柱頭，清洗或更換濾片BackHPLC Business DeptShimadzu Corporation樣品或流動相中雜質(zhì)吸附雜質(zhì)會產(chǎn)生拖尾峰雜質(zhì)會產(chǎn)生拖尾峰使用高溶解性溶劑清洗色譜柱使用高溶解性溶劑清洗色譜柱僅僅 1 cm深度深度會被污染會被污染色譜柱取出污染填料，裝填新的填料取出污染填料，裝填新的填料HPLC Business DeptShimadzu Corporation機(jī)械振動產(chǎn)生空隙8945612370 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx000

24、 0000 0LC-10AD :輸液時不要打開排液閥HPLC Business DeptShimadzu Corporation填料變性硅膠型硅膠型聚合物型聚合物型pH 范圍范圍2 - 7.5廣泛使用廣泛使用有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑所有溶劑所有溶劑有限制有限制壓力壓力低于低于 250 kgf/cm2壓力低壓力低溫度溫度最好低于最好低于60可在高溫下使用可在高溫下使用HPLC Business DeptShimadzu Corporation產(chǎn)生峰變形（如拖尾等）的原因柱進(jìn)口污染柱進(jìn)口污染柱內(nèi)存在空隙柱內(nèi)存在空隙 樣品過載樣品過載溶解樣品的溶劑選擇不當(dāng)溶解樣品的溶劑選擇不當(dāng)二次保留效應(yīng)二次保留效應(yīng)擔(dān)體表面存在硅醇基擔(dān)體表面存在硅醇基擔(dān)體表面殘留重金屬擔(dān)體表面殘留重金屬HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶解樣品的溶劑選擇不當(dāng)最好不要選擇高溶解性的試劑作為溶解樣品的溶劑最好不要選擇高溶解性的試劑作為溶解樣品的溶劑甲醇 作為溶劑Caffeine乙醇 作為溶劑Caffeine乙醇 作為溶劑Caffei