第九章DNA序列分析

1、第九章 DNA序列分析Sequencing and Analysing of DNA DNA的序列分析有兩種基本方法，Maxam-Gilbert化學(xué)降解法和Sanger氏酶學(xué)法。 因?yàn)闇y序每個反應(yīng)讀取的序列是有限的，做長片段DNA或基因組測序時，需要選用一定的策略。 測序的策略有primer walking，隨機(jī)測序，定向測序等。現(xiàn)在全自動測序仍然沿用Sanger氏酶學(xué)法，但是在標(biāo)記上作了改進(jìn)。 DNA測序結(jié)果通過生物信息學(xué)分析，獲取需要的信息。一、Maxam-Gilbert化學(xué)降解法 特點(diǎn)：特點(diǎn)：特定化學(xué)試劑修飾不同堿基，并在相應(yīng)堿基出切斷DNA片段再進(jìn)行序列分析。 原理：原理：將一個 DN

2、A 片段的 5 端磷酸基作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長度不一而 5 端被標(biāo)記的 DNA 片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的 DNA 的堿基序列。 MaxamMaxam- -GilbertGilbert 化學(xué)降解法測序的常用化學(xué)化學(xué)降解法測序的常用化學(xué)試劑試劑 堿基體系 化學(xué)修飾 試劑 化學(xué)反應(yīng) 斷裂部位 G A + G C + T C A C dimethyl sulphate（硫酸二甲酯） Piperidine formate（哌啶甲酸）, pH2.0 hydrazine（肼，聯(lián)氨

3、NH2.NH2） hydrazine + NaCl（1.5M） 90C, NaOH（1.2M） 甲基化 脫嘌呤 打開嘧啶環(huán) 打開胞嘧啶環(huán) 斷裂反應(yīng) G G 和 A C 和 T C A 和 C 作為標(biāo)記用的放射性同位素主要有-32（-32ATP，-32GTP. -32TTP ，或-32CTP），或 -33 NTP Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法不需要進(jìn)行酶催化反應(yīng)，因此不會產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來的誤差；對未經(jīng)克隆的DNA片段可以直接測序； 化學(xué)降解測序法特別適用于測定含有如 5-甲基腺嘌呤A或者G，C含量較高的DNA片段，以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。 自建立以來沒有大的改進(jìn)，操作繁

4、瑣，化學(xué)試劑的毒性大； 放射性同位素標(biāo)記效率偏低，需要較長的放射自顯影曝光時間，人工讀取費(fèi)時費(fèi)力； 目前僅用于分析特殊DNA鏈的核苷酸序列及DNA和蛋白質(zhì)互作中的DNA一級結(jié)構(gòu)。二、Sanger雙脫氧鏈終止法 原理：原理：雙脫氧核苷酸分子的脫氧核糖的 3位置的-OH 缺失。當(dāng)它與其他正常核苷酸混合在同一個擴(kuò)增反應(yīng)體系中時，在 DNA 多聚酶的作用下，雖然它也能夠象正常核苷酸一樣參與 DNA 合成，以其 5位置的磷酸基，與上位脫氧核苷酸的 3位置的-OH 結(jié)合，但是，由于它自身 3位置-OH 的缺失，至使下位核苷酸的 5-磷酸基無法與之結(jié)合。 基于雙脫氧核苷酸的這種特性，Sanger于1977年

5、建立了以雙脫氧鏈終止法為基礎(chǔ)來測定DNA序列的方法。 以待測單鏈或雙鏈DNA為模板，使用能與DNA模板結(jié)合的一段寡核苷酸為引物，在DNA多聚酶的催化作用下合成新的DNA鏈。 反應(yīng)體系中加入了一種放射性同位素32P或35S標(biāo)記的雙脫氧核苷酸（*-ddATP或*-ddCTP或*-ddGTP或*-ddTTP）后，在DNA合成過程中，標(biāo)記的*-ddNTP （例如*-ddATP）將與相應(yīng)的dNTP（例如dATP）競爭摻入到新合成的DNA互補(bǔ)鏈中。 如果是dNTP摻入其中，DNA互補(bǔ)鏈則將繼續(xù)延伸下去；如果是*ddNTP摻入其中，DNA互補(bǔ)鏈的合成則到此終止。而雙脫氧核苷酸的摻入是隨機(jī)的，故各個新生DNA

6、片段的長度互不相同。 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將混合產(chǎn)物中不同長度DNA片段分離開，再通過放射自顯影曝光，根據(jù)片段尾部的雙脫氧核苷酸讀出該DNA的堿基排列順序。 三、DNA測序的基本策略 1、DNA 片段序列分析的策略片段序列分析的策略 Primer walking 隨機(jī)測序（random approach），或稱作鳥槍法（shotgun strategy） 定向測序 引物步移（引物步移（Primer walking） 原理：原理：從目的片段的一端開始，利用載體上的序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)第一次反應(yīng)的反應(yīng)引物進(jìn)行測序，然后，依次根據(jù)前一次測序結(jié)果，設(shè)計(jì)下一次反應(yīng)引物，遞進(jìn)測序，直至完成。 該法需要多次設(shè)

7、計(jì)和合成引物，比較繁瑣；對于重復(fù)序列較多的目的DNA，由于引物的非特異性結(jié)合概率高，所以該方法不適合于測定含有多重復(fù)序列的DNA片段。 隨機(jī)測序（隨機(jī)測序（random approachrandom approach），），鳥槍法鳥槍法（shotgun strategyshotgun strategy） 原理：原理：將待測 DNA 克隆于噬菌體載體（M13）上，然后通過一定手段將待測 DNA 片斷化（DNA 片斷化的手段通常有超聲波處理和酶切），得到兩端彼此重疊的部位不同的若干小片段，再測出每一片段的序列，將各片段的序列依次排列，即能得出總的序列。 定向測序定向測序 基本策略：基本策略：沿著目

8、的 DNA 的同一個方向逐漸向前推進(jìn)，直至目的 DNA 的另一端?？刹捎们短兹笔Хɑ蛞锊揭品?。 嵌套缺失法是利用缺失隨機(jī)突變原理： 先將目的DNA克隆到載體上； 再用限制性內(nèi)切酶在鄰近其一端處切斷載體，使之變成3端凹進(jìn)5端突出的線狀DNA； 再用外切酶（exonuclease ）或者DNase 加Mn+離子，沿此末端逐步消化目的DNA，于是只要控制消化時間，即可得到一組依次相差若干堿基，其一端固定于載體另一端游離的目的 DNA 片斷； 再經(jīng)末端修飾，重新連接，即可得到一群一端相同但長度不等的目的DNA克隆。 之后，用同一引物從缺失端開始測序，最后，排列和比較所有子片斷的序列，即能得到目的 D

9、NA的全部序列。 用嵌套缺失體進(jìn)行DNA測序時，各相鄰缺失體之間的大小差異必須小于一次測序讀取的核苷酸數(shù)目，這樣才能保證各次測定的序列可以找到部分重疊的序列，從而才能完成序列的拼接 2、測序的基本方案、測序的基本方案 制備雙脫氧鏈終止測序的模板制備雙脫氧鏈終止測序的模板 用于雙脫氧鏈終止測序的模板可以是單鏈DNA ，雙鏈DNA ， PCR產(chǎn)物，BAC或Cosmid 。 單鏈 DNA 通常為 M13 噬菌體 DNA（M13mpDNA）， 用于測序的 PCR 產(chǎn)物 DNA 量一般為200-800ng。 在進(jìn)行測序之前，無論選用何種測序策略，用于測序的模板 DNA 均有必要用溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳法

10、確定其純度和濃度，這是保證測序成功的基本點(diǎn)。 確定測序的引物確定測序的引物 DNA 測序的另一關(guān)鍵在于引物的選擇和設(shè)計(jì)。作為測序引物的寡核苷酸的基本條件主要有以下幾點(diǎn)。 引物長度 18-22 堿基； 盡量避免三個以上相同堿基的重復(fù)，尤其是 G 或 C； Tm 值約為 55-60（至少要高于 45）； 發(fā)夾結(jié)構(gòu)盡量少； 引物自身之間不形成二聚體結(jié)構(gòu)； 用滅菌后的去離子水溶解合成的寡核苷酸引物，配制成 5-10pmol/l 濃度，冷凍保存。 引物濃度可以參考算式計(jì)算: pmol/l=100 x A260/（1.54nA + 0.75nC + 1.17nG +0.92nT） A260： 260nm

11、波長時的吸收值。nA：腺嘌呤 A 的數(shù)目；nC：胞嘧啶 C 的數(shù)目；nG：鳥嘌呤 G 的數(shù)目；nT：胸腺嘧啶 T 的數(shù)目。 為保證引物純度，至少應(yīng)該經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳或者純化度更高的 HPLC 純化。 3 3、DNA DNA 自動測序和序列的計(jì)算機(jī)分析自動測序和序列的計(jì)算機(jī)分析 原理原理 ：基于Sanger雙脫氧鏈終止法的原理，只不過不用同位素標(biāo)記ddNTP，而是用四種不同的熒光染料分別標(biāo)記ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。這四種熒光染料在激光激發(fā)下發(fā)出不同波長的熒光，因而每一種熒光代表一種堿基。延伸中的 DNA 互補(bǔ)鏈分別終止于不同熒光標(biāo)記的ddATP、ddTTP、ddCT

12、P、ddGTP。 上圖為測序儀 ABI Prism 310 Genetic analyzer 實(shí)際測得的一段 DNA 序列結(jié)果。紅色代表 T ；綠色代表 A ；藍(lán)色代表 C ；黑色代表 G 。 377型遺傳分析儀型遺傳分析儀 3730型遺傳分析儀型遺傳分析儀 377377型型DNADNA全自動測序儀采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)合全自動測序儀采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)合美國應(yīng)用生物系統(tǒng)美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)(ABI)公司專利的四色熒光標(biāo)記，激光檢測，公司專利的四色熒光標(biāo)記，激光檢測，一個泳道檢測的方法，一個測序反應(yīng)保證一個泳道檢測的方法，一個測序反應(yīng)保證500bp500bp的準(zhǔn)確序列。的準(zhǔn)確序

13、列。 37303730型型DNADNA全自動測序儀采用毛細(xì)管電泳，速度更快，效全自動測序儀采用毛細(xì)管電泳，速度更快，效果更好，通量更大，一個測序反應(yīng)保證果更好，通量更大，一個測序反應(yīng)保證800bp800bp的準(zhǔn)確序列，是當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確序列，是當(dāng)前基因測序的主打。前基因測序的主打。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：i. 四個反應(yīng)系統(tǒng)可合并點(diǎn)樣，大大節(jié)省制膠和點(diǎn)樣時間；四個反應(yīng)系統(tǒng)可合并點(diǎn)樣，大大節(jié)省制膠和點(diǎn)樣時間； ii. 可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射自顯影；自顯影； iii.可連續(xù)電泳，可讀出較多的核苷酸序列?？蛇B續(xù)電泳，可讀出較多的核苷酸序列。缺點(diǎn)：無

14、法保留原始記錄缺點(diǎn)：無法保留原始記錄, 四個反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)在一條道上四個反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)在一條道上, 相互間會相互間會發(fā)生干擾發(fā)生干擾, 導(dǎo)致讀序時分辨率下降。導(dǎo)致讀序時分辨率下降。+光擴(kuò)增量計(jì)算機(jī)激光儀(氬離子)窗口DNA序列分析自動化包括兩序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容，一是指個方面的內(nèi)容，一是指“分分析反應(yīng)析反應(yīng)”的自動化，另一方的自動化，另一方面則是指面則是指“讀片過程讀片過程”的自的自動化。動化。一、在線分析的核心網(wǎng)站一、在線分析的核心網(wǎng)站http:/http:/bip.weizmann.ac.ilh

15、ttp:/bip.weizmann.ac.il/tools/#primary/tools/#primaryhttp:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/二、本地分析的重要軟件二、本地分析的重要軟件Vector NTI Suite 6.0Vector NTI Suite 6.0及以上的版本：綜合分析、載體分析。及以上的版本：綜合分析、載體分析。DNA StarDNA S

16、tar：綜合分析：綜合分析Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0：引物設(shè)計(jì)：引物設(shè)計(jì)Oligo 7Oligo 7：寡核苷酸分析，引物計(jì)算：寡核苷酸分析，引物計(jì)算GCGGCG：蛋白質(zhì)、核酸序列：蛋白質(zhì)、核酸序列四、核苷酸序列的生物信息分析四、核苷酸序列的生物信息分析 序列分析序列分析 基因序列的信息分析：例如，兩種序列的比較；基因編碼領(lǐng)域，啟動子或增強(qiáng)子序列的預(yù)測；蛋白質(zhì)序列的氨基酸順序的預(yù)測； 新基因的發(fā)現(xiàn)：通過分析 EST（Expressed Sequence Tag）序列，結(jié)合 DNA Chip 技術(shù)尋找新基因。 基因多型性分析：分析基因多型性特別是SNP

17、（Single Nucleotide Polymorphism），發(fā)現(xiàn)并定位功能性基因，作為人類群體，進(jìn)化，或者疾病關(guān)聯(lián)靶標(biāo)。 高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測：根據(jù)測序所得到的核酸一級結(jié)構(gòu)的信息，可以預(yù)測核酸和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及其三級結(jié)構(gòu)，從而預(yù)測其功能。 基因數(shù)據(jù)庫：NCBI，EMBL，DDBJ四、未來的測序技術(shù) 1、質(zhì)譜法質(zhì)譜法(mass spectrometry)新型的電離技術(shù)如電噴霧離子化和基質(zhì)輔助激光吸收技術(shù)使利新型的電離技術(shù)如電噴霧離子化和基質(zhì)輔助激光吸收技術(shù)使利用質(zhì)譜法分析大片段用質(zhì)譜法分析大片段DNA 成為可能。其中四極離子捕獲效果成為可能。其中四極離子捕獲效果更好。更好。Fourier轉(zhuǎn)型質(zhì)

18、譜或飛行時間質(zhì)譜可進(jìn)行極轉(zhuǎn)型質(zhì)譜或飛行時間質(zhì)譜可進(jìn)行極 為敏感的為敏感的DNA測序。測序。 2、雜交測序法雜交測序法(seguencing by hybridization,SBH) 雜交測序法是一種創(chuàng)新性的雜交測序法是一種創(chuàng)新性的DNA測序技術(shù)，主要是采用一系列測序技術(shù)，主要是采用一系列n-mer長的所有可能的寡核苷酸與未知長的所有可能的寡核苷酸與未知DNA靶序列進(jìn)行雜交，靶序列進(jìn)行雜交，記錄下最適的雜交記錄下最適的雜交 片段，然后組裝便可獲得未知片段的堿基片段，然后組裝便可獲得未知片段的堿基序列。序列。 3 3、單分子測序法單分子測序法(single-molecule seguencing

19、) 單分子測序法是美國單分子測序法是美國Los Alames國家實(shí)驗(yàn)室國家實(shí)驗(yàn)室(LANL )發(fā)展的一種通過檢測標(biāo)記在單個分子上的發(fā)展的一種通過檢測標(biāo)記在單個分子上的熒光進(jìn)行熒光進(jìn)行DNA快速測序的方法?？焖贉y序的方法。 模板模板DNA分子首先通過酶法修飾或合成，使不同分子首先通過酶法修飾或合成，使不同的熒光素標(biāo)記不同的堿基，然后，用兩個激光束的熒光素標(biāo)記不同的堿基，然后，用兩個激光束(或或稱激光鑷子稱激光鑷子lasertweezer)夾住標(biāo)記的夾住標(biāo)記的DN A分分 子，子，將其置于液流系統(tǒng)，從被固定的核苷酸上游端開始將其置于液流系統(tǒng)，從被固定的核苷酸上游端開始用外切酶逐一切下被標(biāo)記的核苷酸

20、，用外切酶逐一切下被標(biāo)記的核苷酸， 通過單分子熒通過單分子熒光探測器檢測液流中切下的標(biāo)記核苷酸，再根據(jù)檢光探測器檢測液流中切下的標(biāo)記核苷酸，再根據(jù)檢測到的信號順序確定測到的信號順序確定DNA順順 序。序。 4、原子探針顯微鏡測序法原子探針顯微鏡測序法(atomic probe microscopy) 80年代發(fā)展的原子探針顯微鏡技術(shù)如掃描遂道顯微鏡年代發(fā)展的原子探針顯微鏡技術(shù)如掃描遂道顯微鏡(scanning tunneling micro scopes,STM)和原子力顯微鏡和原子力顯微鏡(atomic force microscopes,ATM)使直接檢測使直接檢測DNA分子結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)成

21、為成為 可能?？赡堋TM是由是由IBM Zurich研究所的科學(xué)家發(fā)明的用來研究所的科學(xué)家發(fā)明的用來直接觀察單分子、單原子結(jié)構(gòu)的技術(shù)，最近有人將其應(yīng)用于直接觀察單分子、單原子結(jié)構(gòu)的技術(shù)，最近有人將其應(yīng)用于閱讀閱讀DNA序列。序列。 5、超薄水平凝膠電泳技術(shù)超薄水平凝膠電泳技術(shù)(Horizontal Ultrathin Gel Electropho resis,HUGE) 1990年，年，Swerdlow H首次采用首次采用HUGE技術(shù)進(jìn)行技術(shù)進(jìn)行DNA測序研測序研究。該技術(shù)是在單一超薄凝膠平板上放入多道平行樣品，在究。該技術(shù)是在單一超薄凝膠平板上放入多道平行樣品，在超高壓電場作用下，通過超高

22、壓電場作用下，通過HUGE檢測系統(tǒng)進(jìn)行測序。檢測系統(tǒng)進(jìn)行測序。6、焦磷酸測序、焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術(shù)技術(shù) 焦磷酸測序（焦磷酸測序（PyrosequencingPyrosequencing）技術(shù)是新一代）技術(shù)是新一代DNADNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，序列分析技術(shù)，該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，DNADNA片段也片段也無須熒光標(biāo)記，操作極為簡便。無須熒光標(biāo)記，操作極為簡便。 PyrosequencingPyrosequencing技術(shù)是由技術(shù)是由4 4種酶催化的同一反應(yīng)體種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測

23、序反應(yīng)中，只加入一種只加入一種dNTP,dNTP,若該若該dNTPdNTP與模板配對，聚合酶就與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)（酸基團(tuán)（PPiPPi）。）。 PPiPPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTMPyrogramTM轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為一個峰值。然后加入下一種化為一個峰值。然后加入下一種dNTP,dNTP,繼續(xù)繼續(xù)DNADNA鏈的鏈的合成。合成。 焦磷酸測序反應(yīng)過程：焦磷酸測序反應(yīng)過程：第第1 1步：步：1 1個特異性的測序引物和單鏈個特異性的測序引物和單鏈DNADNA模板結(jié)合，然后加入模板結(jié)合，然后加入酶混合物（包括酶混合物（包括DNA PolymeraseDNA Polymerase、ATP SulfurylaseATP Sulfurylase、LuciferaseLuciferase和和ApyraseApyrase腺苷三磷酸雙磷酸酶）和底物混合物腺苷三磷酸雙磷酸酶）和底物混合物（包括（包括APSAPS腺苷腺苷5-5-磷酰硫酸和磷酰硫酸和LuciferinLuciferin）。）。 第第2 2步：向反應(yīng)體系中加入步：向反