醫(yī)學標書范文

1、溫州醫(yī)學院學科科研項目申請書項目名稱：申請者所在學校申請日期:溫州醫(yī)學院學科科研項目申請書簡表項目名稱研研究類別究研究性質冋基礎研究 應用研究實驗發(fā)展項起止年月2011-6-15 至 2014-6-1目申請金額50000密級機密 秘密 內部般姓名蔣淑麗性別女出生年月1989.7政治面貌預黨民族漢申職稱學歷本科請學位學士人部門部門電話手150885509993968559qq.co家庭電話E-Mail機92m隨著分子生物學的發(fā)展，腫瘤基因治療實驗研究和臨床應用都有了很大 進步，而對膀胱癌的研究有助于其他部位癌癥研究的發(fā)展。從其理論基礎和 相關實驗研究進展進行了分析，并就腫瘤基因治療的新途徑、取得

2、的主要成 就、存在的問題及展望進行了綜述。摘關鍵詞色素上皮衍生因子膀胱癌要色素上皮衍生因子（PEDF ）在膀胱癌中的表 達及其對膀胱癌治療作用的研究立論依據(jù)一、趨勢判斷和需求分析國內外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢（含知識產權狀況和技術標準狀況）；經濟建設和社會發(fā)展需求；科學技術價值、特色和創(chuàng)新點。膀胱癌是危及人類健康的重大疾病，全世界范圍內統(tǒng)計其發(fā)病率占全身腫瘤的第8位，在男性其標準發(fā)病率9.9/10萬；在女性，其標準發(fā)病率為2.3/10萬，占第25位。死亡率在男性為 4.2/10萬，占全身腫瘤死亡率的第9位，在女性為1.1/10萬，占第16位。在我國，膀胱癌也是泌尿外科的最常見惡性腫瘤， 占全身惡性

3、腫瘤的3.2%，1995年，北京市城區(qū)膀胱癌發(fā)病率大約為7/10萬人，上海市城區(qū)發(fā)病率為 8.6/10萬人1，且今后發(fā)病率仍有上升趨勢。作為危害人類健康的常見惡性腫瘤，膀胱癌發(fā)病機制和治療方面 的研究始終是臨床基礎研究的重點之一。目前膀胱癌的治療仍以手術切除為主，輔以膀胱灌注化療和免疫治療、全身化療、放療和生物治療等措施，但這些治療方法效果都不滿意，主要是治療后易復發(fā)，復發(fā)率高達80%，其中大約16%-25%復發(fā)的腫瘤其惡性程度增加，有10%發(fā)展為浸潤性或轉移性癌，因此 ，尋找一種新的、更有效的生物治療方法，是當前臨床迫切需要解決的問題。在膀胱癌的這些輔助性治療方法中，無論是化療還是免疫治療，

4、主要機制是通過直接殺死腫瘤細胞、阻斷腫瘤細胞分裂或誘導細胞調亡的方式來抑制腫瘤生長。做為一種實體性腫瘤生長，腫瘤細胞的增殖 固然重要，而新生血管的形成在腫瘤的生長和復發(fā)、轉移過程中也發(fā)揮非常重要作用。在正常狀態(tài)下， 人體內的脈管系統(tǒng)在血管生長因子和抑制因子網(wǎng)絡式的相互作用下處于平衡狀態(tài)；病理狀態(tài)下，尤其是 發(fā)生惡性腫瘤時，這種平衡向血管生成的方向發(fā)展。當腫瘤生長達到腫瘤組織超過2mm時就會有新生血管形成，如果沒有新生血管生成，腫瘤生長明顯受到抑制，甚至停止2, 3。抗血管生成療法是不同于目前常規(guī)療法的新的腫瘤治療策略，具有高效低毒和不易產生耐藥性的特點4。有關血管生長因子和血管生長抑制因子在腫

5、瘤中所起作用，以及通過抗血管生成治療腫瘤已經成為當前腫瘤研究的一個熱點。近來研究發(fā)現(xiàn)，色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor, PEDF ）是一種對腫瘤有抑制作用的細胞因子。這種細胞因子是Tombran-Tink等在實驗中發(fā)現(xiàn)的，由人視網(wǎng)膜色素上皮細胞分泌的一 種蛋白質，分子量為50 KD5，屬于serpin卵白蛋白/PAT-2亞群，其基因全長16 kb，位于染色體17p13.1-pter 。多項研究表明，PEDF是一種天然的高效的新生血管抑制劑7，并通過誘導腫瘤細胞分化起到抑制腫瘤生長的作用。Tombran-Tink等將PEDF基因定位于染色體1

6、7p13.1,腫瘤發(fā)生與該區(qū)域關系密切，提示該基因可能是抑癌基因或腫瘤相關基因5。對腫瘤細胞進行編碼PEDF的腺病毒轉染，在血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor ， VEGF )存在的情況下， PEDF明顯阻止了血管內皮細胞管 腔形成和遷移。對患有CNV/AMD 患者的體外實驗也發(fā)現(xiàn)，PEDF大量減少的情況下，內皮細胞有明顯遷移；而對照組含有正常水平 PEDF,則抑制了內皮細胞的遷移 6。Crawford等發(fā)現(xiàn)PEDF在神經母細胞瘤 中是腫瘤細胞分化調控的主要的抗血管生成的抑制劑7。肝癌患者血管增生和腫瘤發(fā)展中，PEDF作為VEGF的拮抗因子，

7、起到了抑制作用。對裸小鼠的在體實驗以及鼠的肺癌模型也同樣證明了PEDF對腫瘤的抑制作用。其機制乃因PEDF減少腫瘤微血管的密度，因而可被用于抑制腫瘤新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長，在腫瘤的治療前景上非常樂觀8。我們最近對PEDF在膀胱癌中表達情況的初步研究發(fā)現(xiàn)，PEDF在膀胱癌組織中表達明顯低于正常膀胱組織，而且 PEDF表達情況與膀胱癌的惡性程度以及癌組織中微血管密度呈負相關，提示PEDF在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用，PEDF的正常表達可能抑制膀胱癌細胞的生長、增殖， PEDF有可能成為膀胱癌生物學治療的一種有效的新方法。目前國內、外尚未見此項研究的相關報道。因此我們 設想，擴大樣

8、本量，應用分子生物學技術檢測膀胱癌組織及非癌膀胱組織中PEDF的表達水平，進一步研究PEDF在膀胱癌中的表達情況，并結合臨床資料分析PEDF表達與膀胱癌分期、分級、轉移及預后的關系；通過研究膀胱癌組織中PEDF與VEGF表達的相關性，PEDF與血小板反應素-1表達的相關性，探討膀癌組織中 PEDF表達與腫瘤血管形成的相關性及可能的作用機制；通過研究PEDF表達與金屬蛋白酶-9( MMP-9 )的相關性，探討 PEDF表達與膀胱癌浸潤的相關性；通過研究PEDF表達與已知的對腫瘤生長有明確調節(jié)作用的腫瘤壞死因子a(TNF- a)、白細胞介素 1 a( IL-1 a)、血栓調節(jié)蛋白(thrombom

9、odulin )和白介素8 (IL-8 )等細胞因子表達的相關性，探討PEDF表達對膀癌細胞調節(jié)的可能機制，從而探討 PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用機制；在此基礎上，以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱癌模型，進一步探討PEDF表達對膀胱癌細胞生長的抑制作用以及對膀胱癌的治療效果，為膀胱癌的生物學治療探索一種有效的新方法。參考文獻吳階平，吳階平泌尿外科學，山東科學技術出版社，2004.5: 898-917二、研究內容和技術關鍵研究的總體目標：(1) 研究PEDF表達與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉移及預后的關系，探討PEDF表達在膀胱癌發(fā)生

10、、發(fā)展及轉移過程中可能的作用機制。(2) 研究PEDF對膀胱癌細胞的治療效果，為臨床治療膀胱癌的生物治療探索一種新的有效方法研究的創(chuàng)新點：本課題研究的內容和思路不同于以往的其他研究，應用分子生物學方法從研究PEDF表達與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉移及預后的關系入手，探討PEDF表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和轉移中可能的作用機制。在此基礎上，以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱癌模型，探討 PEDF對膀胱癌的治療作用。目前，本項研究國內、外尚未見報道。本研究的順利完成， 將為膀胱癌的生物學行為的研究開辟了新的途徑，也將為膀胱癌的生物學治療探索一種新的有效方

11、法。研究的主要內容：(1) 膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關細胞因子表達的檢測及相關性研究：應用分子生物學技術研究膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF表達狀況，并檢測 VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-a、IL-1 a、血栓調節(jié)蛋白(thrombomodulin )和IL-8的表達狀況；采用免疫組化技術檢 測膀胱癌組織和非癌膀胱組織中的微血管密度(microvascular density , MVD ),分析PEDF與VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-a、IL-1 a、血栓調節(jié)蛋白和 IL-8表達的相關性，PEDF與MVD的相關性；并結合臨床 資料分析研究PEDF表達與

12、膀胱癌患者 5年生存率之間的關系；闡明 PEDF表達與膀胱癌的發(fā)生、分期、 分級、轉移及預后的關系，探討PEDF表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機制。以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株，以空載轉染膀胱癌細胞株作為對照，觀察檢測VEGF、TNF- a的表達情況及膀胱癌細胞的凋亡、增殖情況。PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療:以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白（購自吉泰生物科技有限公司）直接注射于裸鼠皮下腫瘤組織內作為治療組，以未注射PEDF組為陰性對照組。觀察各組的MVD、VEGF及腫瘤增殖情況，探討 PEDF表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，評估PE

13、DF對膀胱癌的治療效果，為進一步過度到臨床應用提供依據(jù)。需要解決的技術關鍵：（1）連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株的轉染成功率。（2）PEDF定量檢測：我們已有對前列腺癌、腎癌、膀胱癌等組織標本的PEDF定量分析的基礎，已形成較成熟技術條件、設備和研究經驗。（3）膀胱癌裸鼠模型的構建。我們已有成功構建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型的經驗。研究方法：方法（1）膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關細胞因子表達的檢測及相關性研究：實驗組對照組標本A期膀胱癌組織B期C期D期癌旁膀胱組 織非癌膀胱組織正常膀胱組 織炎性膀胱組 織例數(shù)30303030120120120 .應用SYBRGre

14、en I實時定量聚合酶鏈反應（real-time PCR技術,對膀胱癌、非癌膀胱組織中PEDF進行定量測定。 .Western blot 法檢測 VEGF TSP-1、MMP-9 .ELISA法檢測TNF- a、IL-1 a、血栓調節(jié)蛋白、IL-8濃度。 .免疫組化方法檢測標本MVD .整理臨床資料：膀胱癌患者性別、年齡、組織病理、分期、分級、是否轉移、5年生存率。 .數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（使用SPSS統(tǒng)計分析軟件）：PEDF與VEGF表達的相關性。PEDF與 TSP-1表達的相關性PEDF與 MMP-9表達的相關性IL-8濃度的相關性。PEDF與 TNF- a、IL-1 a、血栓調節(jié)蛋白、PEDF與

15、組織MVD相關性。PEDF與膀胱癌分期的相關性。PEDF與膀胱癌惡性程度（分級）的相關性。PEDF與膀胱癌轉移的相關性。PEDF與膀胱癌5年生存率的相關性。方法（2）PEDFX寸膀胱癌細胞株的治療：以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞，以空載轉染膀胱癌細胞作為對照，檢測VEGFTNF-a濃度，觀察細胞的增殖、凋亡情況，分析相關性。 . 以RT- PCR法擴增PEDF基因。 .將擴增后的PEDF基因連接入腺病毒載體，轉染膀胱癌細胞。并以空載轉染為對照。 . Western blot 法檢測 VEGF、TSP-1、MMP-9表達。 .觀察膀胱癌細胞增殖、侵襲、凋亡情況。 .統(tǒng)計分析。

16、方法（3） PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下腫瘤內作為治療組，以未注射 PEDF為陰性對照組。觀察兩組膀胱癌組織 MVD VEGF表達情況、腫瘤增殖情況，評 價PEDF對膀胱癌的治療效果。 .以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下構建膀胱癌裸鼠模型。 .將PEDF蛋白注射于裸鼠瘤體內。 .應用免疫組化方法檢測 MVD應用 Western blot 法檢測VEGF TSP-1、MMP-9觀察腫瘤增殖、凋亡情況。分析PEDF與 VEGF的相互作用關系及其對腫瘤生長的作用機制。技術路線：（1）膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF及

17、相關細胞因子表達的檢測及相關性研究：膀胱癌標本120例癌旁膀胱組織標本120例正常膀胱組織標本120例炎性膀胱組織標本120例"1J、RT-PCR 檢測 PEDFWestern blotELISA法檢測TNF-免疫組化方法檢測mRNA表達法檢測VEGFa、IL-1 a、血栓調標本微血管密度TSP-1、MMP-9節(jié)蛋白、IL-8濃度(MVD結合臨床資料，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(2) PEDF對膀胱癌細胞株的治療：將PEDF轉染膀胱癌細胞株，檢測VEGF TSP-1、MMP-9 TNF- a濃度，觀察腫瘤細胞的增殖、凋亡RT PCR法擴增 PEDF基因a空載體連接入腺病毒載體-1-轉染膀胱癌細胞株

18、-1-情況。結果分析（3）PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：觀察PEDF與 VEGF MVD相關性及其對膀胱癌細胞的抑制作用構建膀胱癌裸鼠模型注射PEDF蛋白|I未注射（對照）/觀察微血 管密度（MVDVEGF TSP-1、MMP-9定量測疋腫瘤凋亡、增殖、侵襲情況結果分析先后開展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基礎研究（包括分子生物學研究）和臨床研究，如：裸鼠膀胱癌模型的建立、 CD44基因、端粒酶、P53和Ras基因等表達與膀胱癌的關系、VEGF表達與膀胱癌的關系等，熟練掌握了泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤分子生物學和細胞學研究的技術方法，如RT-PCR、southern、northern雜交、DNA測序、擁

19、有獨立的泌尿外科免疫、病理、分子生物學和細胞學實驗室，實驗室設備 完善，技術方法先進，擁有 PCR-擴增儀、酶標儀、各種電泳槽、凝膠成像設備、細胞房及各種基礎實驗 設備等,為本課題的順利進行提供了有力的技術和儀器設備保證。細胞培養(yǎng)、腺病毒載體構建等技術，積 累了較豐富的研究經驗。最近我們開展了對膀胱癌、前列腺癌組織中PDEF表達的初步研究，掌握了對腫瘤組織包括膀胱癌組織中PDEF表達的檢測方法，對本課題的順利進行提供了便利條件。例如：已完成對膀胱腫瘤與正 常膀胱組織PEDF表達情況的對照性研究，初步結果顯示如下：（1）定量PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果可見：PEDF在正常膀胱組織中高表達，而在膀

20、胱癌組織中表達明顯降低（見圖 1）。MM2 N3 T1 T2 T33002SO100500100精品文檔注：N1 , N2, N3 :正常膀胱組織T1 , T2 , T3 :膀胱癌組織GAPDH :內參照M:為標記分子量圖1 :正常膀胱組織與膀胱癌組織 PEDF定量PCR（3）在膀胱癌組織中PEDF低表達與微血管增殖相關（見圖 2）。 進度安排；2011- 6-至 2012-3完成膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關細胞因子表達的檢測及相關性研究2012- 3 至 2 013-3PEDF對膀胱癌細胞株的治療2013- 3 至 2014-6PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療預期成果：（1）明確測定出PEDF在膀胱癌中的表達情況以及其與相關細胞因子表達之間的關系。（2）PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。（3）PEDF對膀胱癌的治療有效，為最終過渡到臨床應用提供強有力的實驗依據(jù)。成果以論文的形式表達，并申請“PEDF治療裸鼠膀胱癌模型技術”的專利；擬發(fā)表論著5-7篇,其中國內權威雜志 4 5篇，SCI收錄雜志2篇。申請成果鑒定。本課題實施過程中，形成一整套的細胞因子檢測方法、膀胱癌細胞株培養(yǎng)及腺病毒轉染膀