分子生物學(xué)補(bǔ)充

1、基因工程是在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒(méi)有這類(lèi)分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。 第一部分 基因表達(dá) 基因工程的主要內(nèi)容或步驟 1、 從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。（切） 2、 在體外，將帶有目的基因的外源DNA 片段連接到能自我復(fù)制的并具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子。（連） 3、 將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（寄主細(xì)胞），并與之一起繁殖。（轉(zhuǎn)、篩） 4、 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。（擴(kuò)） 5、 從這些篩選出的受

2、體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)散的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。 6、將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)出人類(lèi)所需要的物質(zhì)。 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá) 常用載體：1. Prokaryotic expression vector 原核表達(dá)載體 2. Baculovirus expression vector 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體 3. Mammalian expression vector 哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 4. Yeast expression vector 酵母表達(dá)載體 5. Adenoviral and retrov

3、iral vector 腺病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 外源基因具備的條件：1.編碼區(qū)不含插入序列；（mRNA-cDNA）2.位于啟動(dòng)子下游，方向一致，原有的讀碼框不變；3.含起始密碼子、終止密碼子；4.轉(zhuǎn)錄出的mRNA必須有SD序列，調(diào)整SD序列與第一個(gè)AUG間的距離（因?yàn)闀?huì)對(duì)轉(zhuǎn)譯效率有影響）；5.產(chǎn)物比較穩(wěn)定（如：融合蛋白、信號(hào)肽）；6.選擇系統(tǒng)偏好的簡(jiǎn)并密碼。影響外源基因表達(dá)的因素： 1.啟動(dòng)子的強(qiáng)弱（主要因素） 2.基因的劑量3.RNA轉(zhuǎn)譯效率（SD互補(bǔ)、AUG-SD距離及序列、AUG前后核苷酸序列的適宜性）4.密碼子5.表達(dá)產(chǎn)物的大小6.產(chǎn)物的穩(wěn)定性受體細(xì)胞的選擇不同類(lèi)型的細(xì)胞具有不同的

4、特征，對(duì)要表達(dá)的外源基因具有不同的適應(yīng)性。如：CHO細(xì)胞、CV-1或NIH-3T3選擇標(biāo)記特定細(xì)胞、選擇標(biāo)記、選擇性培養(yǎng)基特定的選擇系統(tǒng)。常用的：胸苷激酶基因、二氫葉酸還原酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng)等。導(dǎo)入細(xì)胞：轉(zhuǎn)化（transformation):指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入原核生物里面的過(guò)程。轉(zhuǎn)染(transfection):指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):轉(zhuǎn)導(dǎo)是指通過(guò)病毒將一個(gè)宿主的DNA轉(zhuǎn)移到另一個(gè)宿主的細(xì)胞中而引起的基因重組現(xiàn)象。（狹義：指以噬菌體為載體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移DNA的過(guò)程。）導(dǎo)入細(xì)胞的方法：重組體

5、導(dǎo)入細(xì)胞的方法 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 （磷酸鈣沉淀 顯微注射 脂質(zhì)體 DEAE-dextran ）酵母菌電轉(zhuǎn) 大腸桿菌 CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，熱攻擊法轉(zhuǎn)化 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測(cè)：1.IPTG誘導(dǎo)2.溫度誘導(dǎo)3.檢測(cè):SDS-PAGE電泳第二部分 蛋白質(zhì)的純化 蛋白質(zhì)的分離純化的一般原則一、原料的選擇：富集于哪種組織、細(xì)胞；胞外or胞內(nèi)表達(dá)。組織和細(xì)胞的破碎方法：勻漿、電動(dòng)搗碎、超聲破碎、反復(fù)動(dòng)融。細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞二、粗分：簡(jiǎn)單、易處理、快速。如利用蛋白質(zhì)溶解度不同，在不同pH值下，不同飽和度的硫酸銨沉淀；有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀；分級(jí)離心等。三、精制備 ：離子交換層析、分子篩、吸附層析、親核

6、層析、電泳、離心、結(jié)晶以及一些免疫的方法。 注意保持生物活性，如pH值、溫度、加入酶的抑制劑、金屬離子絡(luò)合劑（EDTA）等。 蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù) ：1.溶解度差別2.分子大小不同3.蛋白質(zhì)分子帶電性質(zhì)不同4.蛋白質(zhì)吸附性質(zhì)不同5.蛋白質(zhì)的特異性配體原理應(yīng)用 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL)的表達(dá)、純化和抗腫瘤活性研究技術(shù)路線 引物設(shè)計(jì) 表達(dá)載體 ：TRAIL全基因及可溶型sTRAIL基因PCR擴(kuò)增 提取正常人外周血淋巴細(xì)胞總RNATRAIL全基因的獲得以該總RNA為模板，用寶生物公司的BeaBEST 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以該反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，加入引物P1，P2進(jìn)行第一次PCR。

7、sTRAIL基因的獲得以TRAIL全基因經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物為模板，加入引物P1，P2，再次PCR sTRAIL基因，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。含腸激酶位點(diǎn)的pThioHisA-sTRAIL表達(dá)載體的構(gòu)建 純化后的TRAIL、sTRAIL PCR產(chǎn)物用BamHI、EcoRI雙酶切。質(zhì)粒pThioHisA用同樣的酶雙酶切，膠回收酶切片段，T4 DNA連接酶分別連接經(jīng)雙酶切的片段TRAIL、sTRAIL和質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，篩選陽(yáng)性克隆。小提質(zhì)粒，酶切鑒定重組子，并對(duì)重組子進(jìn)行測(cè)序分析。誘導(dǎo)表達(dá) pThioHisA-sTRAIL在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)。3.0 mmol/L IPTG

8、誘導(dǎo)6-8 h，表達(dá)達(dá)到高峰，經(jīng)薄層掃描目的蛋白約占菌體總蛋白的39左右。表達(dá)產(chǎn)物部分可溶，其余形成包涵體。融合表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE表觀分子量為32000 Dalton左右（實(shí)際分子量為35608.21 Dalton）。sTRAIL融合蛋白的制備 工程菌的培養(yǎng)：挑取陽(yáng)性克隆，接種于200mL含100g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)過(guò)夜。然后以10-20的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)。超聲破碎菌體：離心收獲的菌體按0.2g/mL重懸于A液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.2mol/L NaCl，5mmol/L咪唑)，冰浴中超聲破碎。12,000rpm/min離心

9、15min，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析目的蛋白以可溶性還是以包涵體形式存在。sTRAIL融合蛋白的純化 1.融合表達(dá)載體pThioHisA在硫氧還蛋白融和段帶有組氨酸標(biāo)簽，用Ni2+固相化的Chelating Sepharose Fast Flow填料進(jìn)行親和層析。2.將可溶性表達(dá)產(chǎn)物（超聲破碎菌體的離心上清）與親和柱結(jié)合，用2倍柱床體積以上的A液過(guò)柱，至基線平穩(wěn)；用B液 (A液中加入咪唑至終濃度為50mmol/L) 梯度洗脫510個(gè)柱體積，用AKATA Explore進(jìn)行檢測(cè)，收集各洗脫峰。sTRAIL融合蛋白的腸激酶切割及純化 1. sTRAIL融合蛋白的腸激酶切割：按sTR

10、AIL融合蛋白：腸激酶不同體積的比例酶切，SDS-PAGE分析。2.sTRAIL非融合蛋白的純化：以A液（25mM pH7.0的磷酸緩沖液）平衡 SP Sepharose Fast Flow離子交換柱，將酶切后的反應(yīng)液直接上柱，以B液（25mM pH7.0的磷酸緩沖液0.6M NaCl）梯度洗脫，收集洗脫峰，以分離除去融合頭。其中的目的峰再用分子篩Sepharyl S-200做進(jìn)一步純化及脫鹽處理。用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE分析檢測(cè)。sTRAIL融合蛋白及非融合蛋白的 Western Blot檢測(cè)第一抗體：兔抗人TRAIL多克隆抗體，1:1000稀釋?zhuān)?第二抗體：HR

11、P標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，1:10000稀釋。 新基因功能研究的策略與方法基因功能的研究策略主要包括：一.新基因的生物信息學(xué)及體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析;二.新基因的體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析三.功能獲得與功能失活策略研究;四.功能失活策略五.基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究一.新基因的生物信息學(xué)及體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析目前，生物信息學(xué)分析已成為新基因功能研究首選和必用方法，其具有方便快捷和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。研究者往往可以從中得到與新基因功能有關(guān)的重要信息，初步推測(cè)基因的可能功能，進(jìn)而制定出進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室研究方案。（1）編碼產(chǎn)物預(yù)測(cè)分析（2）序列同源性分析（3）蛋白質(zhì)功能域分析二.新基因的體內(nèi)表達(dá)規(guī)律分析要開(kāi)展新基因功能的研究

12、工作，首要的研究任務(wù)摸清新基因在體內(nèi)的表達(dá)規(guī)律。包括從mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上來(lái)對(duì)其基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，即看其在各種不同的正?；虿B(tài)組織細(xì)胞中是否表達(dá)以及表達(dá)的水平高低等.新基因在某一特定的正常組織細(xì)胞中的表達(dá)水平高往往提示其在其中發(fā)揮著重要作用，而新基因在相應(yīng)的病態(tài)組織中的表達(dá)異常則提示與該病理過(guò)程相關(guān)的生物學(xué)意義。（1）mRNA水平的表達(dá)譜分析；（2）蛋白質(zhì)水平的表達(dá)分析。三.功能獲得策略新基因功能研究的功能獲得策略即通過(guò)將新基因直接導(dǎo)入到某一細(xì)胞或個(gè)體中，通過(guò)觀察細(xì)胞生物學(xué)行為或個(gè)體表型遺傳性狀的變化來(lái)鑒定基因的功能，常用的方法有：（1）基因轉(zhuǎn)染技術(shù)（2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)四.功能失活策略通過(guò)

13、觀察某一細(xì)胞或個(gè)體在新基因的功能部分或全部失活后的細(xì)胞生物學(xué)行為或個(gè)體表型遺傳性狀變化來(lái)鑒定基因的功能。常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技術(shù)和基因敲除等1）基因沉默技術(shù)（2）基因敲除五.基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究細(xì)胞各種基本功能的完成離不開(kāi)蛋白質(zhì)之間的相互作用以及通過(guò)相互作用而形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此，確定能夠與新基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)終產(chǎn)物相互作用的上下游蛋白質(zhì)分子，也是研究新基因功能的一個(gè)十分重要的方面。目前常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)包括傳統(tǒng)的基親和分析而建立的免疫共沉淀技術(shù)和酵母雙雜交系統(tǒng).（1）免疫共沉淀技術(shù)（2）酵母雙雜交系統(tǒng)編碼產(chǎn)物預(yù)測(cè)分析研究者往往最開(kāi)始得到有價(jià)值的EST

14、序列，進(jìn)而通過(guò)電子延伸或和相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法獲取其全長(zhǎng)cDNA序列。這種情況下，首先要進(jìn)行即是進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA序列的開(kāi)放閱讀框查找，推導(dǎo)其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。 然后，進(jìn)行信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)分析。初步判定其亞細(xì)胞定位，再進(jìn)行蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析，包括氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、親/疏水性等。最后，以已知的氨基酸序列的基礎(chǔ)，分析預(yù)測(cè)其高級(jí)結(jié)構(gòu)。序列同源性分析包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析，這也是目前生物信息學(xué)技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的基本技術(shù)之一。主要采用BLAST和FASTA程序進(jìn)行，即從已知的各種核酸和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與新基因?qū)?yīng)的功能已知的高度同源基因和蛋白質(zhì)，從這些已知基因和

15、蛋白質(zhì)的功能信息中來(lái)初步推測(cè)和判斷新基因的功能。 同時(shí)，因?yàn)槿祟?lèi)全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，所以以新基因的cDNA序列來(lái)對(duì)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，則可很方便地獲得與其完全同源基因組DNA序列及其染色體定位信息，而無(wú)需進(jìn)行熒光原位雜交等基因染色體定位技術(shù)，進(jìn)而還可通過(guò)分析其內(nèi)含子、外顯子序列及其調(diào)節(jié)位點(diǎn)，推測(cè)其可能的基因表達(dá)調(diào)控方式。即通過(guò)此法確定了富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白新基因的基因組DNA序列及其染色體定位。蛋白質(zhì)功能域分析主要是通過(guò)聯(lián)網(wǎng)或數(shù)據(jù)庫(kù)行蛋白質(zhì)是基因功能的體現(xiàn)者和施行者，而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)則是蛋白質(zhì)執(zhí)行生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，因此對(duì)新基因所編碼蛋白質(zhì)的功能域分析將對(duì)推測(cè)新基因功能提供極其有價(jià)值的

16、信息。目前，已經(jīng)有大量被發(fā)現(xiàn)的蘊(yùn)藏于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的與特定生物學(xué)活性相關(guān)的所謂保守模體mRNA水平的表達(dá)譜分析對(duì)新基因在mRNA 水平上的表達(dá)分析涉及到的技術(shù)有半定量RT-PCR 、實(shí)時(shí)定量RT-PCR 和Northern Blot 等。半定量RT-PCR方法具有簡(jiǎn)便、快捷和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，但其存在著精確度不高和不能進(jìn)行絕對(duì)定量等缺點(diǎn)，多用于基因表達(dá)水平的快速初步分析。實(shí)時(shí)定量RT-PCR是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種mRNA定量分析技術(shù)，因具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染和自動(dòng)化程度高等的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，但其成本相對(duì)較高。Northern Blot歷來(lái)是在mRNA水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析的經(jīng)典技術(shù)，

17、被各實(shí)驗(yàn)室廣泛采用其不僅可以進(jìn)行定量分析，而且還能夠檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄本的大小及種類(lèi)，這也是RT-PCR技術(shù)所不具備的優(yōu)勢(shì)但Northern Blot操作較為繁瑣，采用放射性標(biāo)記時(shí)也存在放射性污染的問(wèn)題。在實(shí)際工作中，需結(jié)合這兩類(lèi)方法同時(shí)進(jìn)行，互為補(bǔ)充。另外，必要時(shí)也應(yīng)考慮使用原位雜交技術(shù)來(lái)對(duì)新基因的mRNA在特定組織細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行定位觀察。蛋白質(zhì)的水平表達(dá)分析 確定新基因在哪些組織細(xì)胞被轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)一步的工作則是制備相應(yīng)的抗體來(lái)檢測(cè)其蛋白質(zhì)終產(chǎn)物的表達(dá)情況，如該蛋白質(zhì)表達(dá)的亞細(xì)胞定位、分子質(zhì)量大小、聚體形式等。這種在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)分析涉及到的常用技術(shù)主要是Western Blot和免疫組化等。

18、其中，Western Blot與Northern Blot類(lèi)似，不僅可以進(jìn)行定量分析，而且還能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大小及其聚體形式。而免疫組化技術(shù)的優(yōu)勢(shì)則在于其能夠確定蛋白質(zhì)是在特定組織中的哪些細(xì)胞以及在特定細(xì)胞的哪個(gè)部位中表達(dá)。另外，對(duì)于病態(tài)組織細(xì)胞而言，在mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上的新基因的表達(dá)分析，還可以提供其基因表達(dá)調(diào)控的大致規(guī)律，譬如是主要在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平上被調(diào)控的。不少研究表明，細(xì)胞內(nèi)特定基因的mRNA水平變化和蛋白質(zhì)水平變化的一致性很差。基因轉(zhuǎn)染技術(shù) 通過(guò)基因轉(zhuǎn)染，即將目的基因轉(zhuǎn)入某一細(xì)胞中通過(guò)觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化來(lái)認(rèn)識(shí)基因的功能，是目前應(yīng)用最多、技術(shù)最成熟的基因功

19、能研究方法。如經(jīng)典的RAS癌基因的功能即通過(guò)轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞而得以鑒定目前常用的基轉(zhuǎn)染系統(tǒng)分為非病毒性表達(dá)系統(tǒng)和病毒性表達(dá)兩種，非病毒性表達(dá)載體目前主要采用質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)、電穿孔等方法使目的基因被宿主細(xì)胞攝取，然而，盡管這類(lèi)表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，其也有不少局限性，主要問(wèn)題是，不同細(xì)胞類(lèi)型對(duì)外源DNA的攝取能力有所不同，尤其在初級(jí)未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中幾乎是無(wú)效的，而初級(jí)細(xì)胞對(duì)于觀察基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性等行為恰恰非常有用。然而，病毒性載體，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用卻能夠很好的解決此問(wèn)題，這類(lèi)以病毒為載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移因其具有轉(zhuǎn)染效率高、目的基因可穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因

20、技術(shù)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，則可將外源基因引入動(dòng)物體內(nèi)，建立攜帶并且能夠遺傳給子代的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表型分析研究外源基因的功能，目前已經(jīng)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立了數(shù)千種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并且還可以通過(guò)在攜帶外源基因的載體上加上組織特異性啟動(dòng)子等手段，從而控制外源基因在特定的時(shí)間或特定的組織器官表達(dá)。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)研究基因功能的優(yōu)勢(shì)在于它是一個(gè)在活體水平上的多維的研究體系，可以從分子到個(gè)體水平進(jìn)行多層次、多方位的研究?；虺聊夹g(shù)這類(lèi)技術(shù)中最常用的主要為反義寡核苷酸（ASON）、核酶和RNA干擾（RNAi）技術(shù)。然而，包括這3種技術(shù)在內(nèi)的該類(lèi)技術(shù)均具有誘導(dǎo)干擾素和其它細(xì)胞因子表達(dá)等非特異性效應(yīng)，另外，它們也會(huì)因?yàn)樽饔门c和靶分子序列相近的分子而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，其中，ASON因使用劑量大，其非特異性效應(yīng)最大；而RNAi的這兩種副效應(yīng)最小基因敲除 或稱(chēng)基因打靶，是建立在胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上的一種方法。既可以在細(xì)胞水平上進(jìn)行，從而建立新的細(xì)胞系，也可以在整體水平進(jìn)行以建立基因敲