鹽誘導(dǎo)激酶1在高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積中的作用及二甲雙胍的干預(yù)

1、鹽誘導(dǎo)激酶 1 在高糖誘導(dǎo)的 HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積中的作用及二甲雙胍的干預(yù)目的肝臟是通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝來(lái)維持系統(tǒng)能量平衡的 重要臟 器。肝臟的脂質(zhì)合成與葡萄糖代謝是密切相關(guān)的 , 當(dāng)肝臟中的 葡萄糖水平 超過(guò)肝臟糖原的儲(chǔ)存能力時(shí) , 葡萄糖通過(guò)糖酵解、氧化等 途徑就轉(zhuǎn)化成游 離脂肪酸 , 作為甘油三酯 (Triglycerides,TG) 合成的 底物 ,使 TG 過(guò)多地聚 集在肝臟的細(xì)胞內(nèi) ，導(dǎo)致脂肪性肝的形成。在高 濃度葡萄糖 ( 高糖)培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肝細(xì)胞脂肪變性和 高糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)的動(dòng)物非酒精性 脂肪肝病 (Non-alcoholic fatty liver

2、 disease,NAFLD) 模型中 ,均可發(fā)現(xiàn)生脂基 因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 -1c(Sterol regulatory element-binding Protein-1c,SREBP-lc), 脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase,FASN) 和乙酰輔 酶 A 羧化酶 (Acetyl CoA carboxylase a,ACC1) 的表達(dá)增加 ， TG 的含量增 多。二 甲雙胍作為一磷酸腺苷活化性蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase,AMPK) 的沖動(dòng)劑 ，能恢復(fù)高糖抑制的 AMPI 蘇氨酸 172 位點(diǎn) (AMPKpThr 172,

3、是 AMPK 勺磷酸化位點(diǎn) )的活性 ,減少高濃度葡萄糖引 起的 HepG2 細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成。鹽誘導(dǎo)激酶 1(Salt induced kinase 1,SIK1) 屬于 AMP 傢族 ,參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的脂代謝 ，能直接調(diào)節(jié) SREBP-1c 勺表達(dá)和 活性。在 2 型糖尿病并發(fā)的非酒精性脂肪肝病的 大鼠肝臟中 ,SIK1 的表達(dá) 降低,SREBP-1c的表達(dá)增加，TG含量增加。 過(guò)表達(dá)SIK1能降低 SREBP-1 (及其下游生脂基因 FASr 和 ACC 的水平。 我們近期報(bào)道了在高濃度葡萄糖孵育的大鼠腎系膜的細(xì)胞系 HBZY-1 細(xì)胞 中,SIK1的mRN和蛋白水平是降低的,同樣SI

4、K1的活性也是降低的(通 過(guò)檢測(cè) SIK1 磷酸化位點(diǎn)絲氨酸 182 位點(diǎn)的蛋白水平 ,SIK1 pThr 182, 與其對(duì)應(yīng)的是 AMPK pThr 172 ,導(dǎo)致系膜細(xì)胞的增殖。然 而 ,SIK1 在高糖誘導(dǎo) 的 HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積中的作用 ，以及二甲雙 胍是否可以通過(guò)調(diào)節(jié) SIK1 來(lái)調(diào)控高糖誘導(dǎo)的 HepG2 細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉 積并不清楚。因此 ,我們采用高 糖誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積模型 ， 首次探討 SIK1 在高糖誘導(dǎo)的 HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積中的作用 ， 并通過(guò) 在 HepGZ 田胞中高表達(dá) SIK1 和二甲雙胍的干預(yù) ，進(jìn)一步研究二甲雙胍 是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)

5、 SIK1 來(lái)調(diào)控 高糖誘導(dǎo)的 HepGZ 田胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。 方法 1.人類(lèi)肝癌細(xì)胞系 HepG2 細(xì) 胞培養(yǎng)在含有正常糖 5.5 mmol/L D- 葡萄糖 、10%0 臺(tái)牛血清 Foetal bovine serum,FBS 、雙抗 100ug/mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素 的 DME 培養(yǎng)基中。放進(jìn)濕潤(rùn)環(huán)境的培養(yǎng) 箱二氧化碳濃度為 5%, 溫度設(shè)置是 37C中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)融合到大約80%時(shí)，在無(wú)血清的正 常糖葡萄糖的濃度為5.5 mmol/L 培養(yǎng)液中無(wú)血清化24h。然后,HepG2 細(xì)胞在高濃度葡萄糖 葡 萄糖的濃度為 25mmol/L, 高糖中培養(yǎng) 2

6、4h 誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉 積的模型。 HepG2 細(xì)胞中的脂滴情況通過(guò)油紅 0 染 色進(jìn)行觀(guān)察 ，細(xì)胞 中 TG 的含量使用 TG 試劑盒檢測(cè) ，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反 應(yīng) Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR 和 WesternBlot 分別檢測(cè) SIK1 、SREBP-1C FASN ACC1 的 mRNA 口蛋白水 平的表 達(dá)Western Blot檢測(cè)SIK1 pThr 182 的蛋白表達(dá)水平 即SIK1的 活 性 , 細(xì)胞經(jīng)免疫熒光技術(shù)后 , 激光共聚焦顯微鏡 Confocalmicroscopy 下觀(guān)察

7、SIK1 在細(xì)胞內(nèi)的分布。 2.為了確定 SIK1 與高糖 誘導(dǎo)的脂質(zhì)合成的直接關(guān)系 ，構(gòu)建重組質(zhì)粒 GV230-SIK1, 轉(zhuǎn)染到HepG細(xì)胞，正常糖培養(yǎng)轉(zhuǎn)染48h后,RT-PCR和Western Blot檢測(cè)SIK1的 轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染 48h 后的 HepGZ 田胞 ,高濃度葡萄糖進(jìn)一步處理 24h, 細(xì)胞 中的脂滴情況通過(guò)油紅 0 的染色進(jìn)行觀(guān)察 ,TG 在細(xì)胞中的含量通 過(guò)使用 TG 試劑盒檢測(cè) ,RT-PCR 和 Western Blot 分別檢測(cè) SIK1 、 SREBP-1C FASNACC1的mRN和蛋白水平的表達(dá) Western Blot檢 測(cè)SIK1 pThr 182 的蛋

8、白水平 即 SIK1 的活性 ,SIK1 在細(xì)胞內(nèi)的分 布在 Confocal microscopy下進(jìn)行觀(guān)察。 3. 研究說(shuō)明二甲雙胍能抑制 高糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成 為了研究二甲雙胍是否可以通過(guò)調(diào)節(jié) SIK1 來(lái)抑制高糖誘導(dǎo)的 HepG2 田胞 內(nèi)的脂質(zhì)沉積 ，我們將 HepG2 細(xì)胞 放在含正常糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng) , 融合 至大約80%,用正常糖培養(yǎng)基 不 含血清的進(jìn)行無(wú)血清化培養(yǎng)24h,二甲 雙胍預(yù)處理1h,再用高糖培養(yǎng) 基培養(yǎng)24ho MTT法觀(guān)察二甲雙胍對(duì) HepG2 細(xì)胞存活的影響 ，觀(guān)察細(xì)胞 內(nèi)的脂滴形成情況和甘油三脂的含量 , 檢測(cè) SIK1 、 SREBP- 1 C 、FA

9、SN 、 ACC1 的 mRN 和蛋白水平的表達(dá) ，以及 SIK1 pThr 182 的蛋白水平 即 SIKI 的活性 ,SIK1 在細(xì)胞內(nèi)的分布在 Confocal microscopy 下進(jìn)行 觀(guān)察。結(jié)果 1.高糖 葡萄糖濃度為 25 mmol/L 培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞 24h 后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成明顯增加 ,TG 的含量明顯增多 ；生 脂基因SREBP-lc FASN ACC1 的表達(dá)增加;2.高濃度葡萄糖25mmol/L/D- 葡萄糖培養(yǎng)HepG2田胞24h后,SIK1的表達(dá)和活性降低,SIK1從細(xì)胞質(zhì) 向細(xì)胞核 轉(zhuǎn)移SIK1入核。3.在HepG2田胞中過(guò)表達(dá)SIK1,會(huì)抑制高 糖誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成和生脂基因 SREBP-1c FASNACC1 的表達(dá)。 4.二甲雙胍處理后 ，會(huì)抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的 HepG2 細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì) 合 成和脂質(zhì)合成基因 SREBP-1c FASN ACC1 的表達(dá)。 5.二甲雙胍能 活化 SIKI, 上調(diào) SIK1 的 mRNAtt 蛋白表達(dá)水平 ，SIK1 局部從細(xì)胞核向 細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移 SIK1 出核 。結(jié)論高糖 葡萄糖的濃度為 25 mmol/L 能誘 導(dǎo) HepGZ 田胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積 ；高糖培