細菌特殊耐藥表型檢測β內酰胺酶的檢測產(chǎn)β內酰胺酶是導致細菌

1、細菌特殊耐藥表型檢測一、 內酰胺酶的檢測產(chǎn)內酰胺酶是導致細菌對內酰胺類抗生素耐藥的主要原因，其中尤以超廣譜內酰胺酶和染色體或質粒介導的Ampc酶以及近年來出現(xiàn)的碳青霉烯酶最為重要。1. 青霉素酶的檢測：顯色頭孢菌素法是目前臨床實驗室檢測青霉素酶最常用的方法之一。其原理是受試菌產(chǎn)生的青霉素酶水解頭孢硝噻吩分子結構中的內酰胺環(huán)，產(chǎn)生由黃色向紅色轉變的顏色反應，即為青霉素酶試驗陽性。操作步驟：將受試菌直接涂布于經(jīng)無菌水濕潤后的頭孢硝噻吩紙片上，觀察顏色反應，產(chǎn)生紅色者為青霉素酶檢測結果陽性。如下圖所示 2超廣 譜內酰胺酶（ESBLs）的檢測：ESBLs是一類在廣譜酶TEM、SHV的酶基因發(fā)生15個以

2、上核苷酸的點突變衍化而來的系列酶，可同時水解青霉素類、頭孢菌素類以及單環(huán)類的氨曲南的活性可被酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦或三唑巴坦所抑制。產(chǎn)ESBLs的菌株主要見于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和奇異變形桿菌。 目前，臨床微生物實驗室檢測產(chǎn)ESBLs菌株的方法主要有初篩試驗、協(xié)同試驗和酶抑制劑增強試驗。（1）、初篩試驗：初篩試驗有紙片法和稀釋法兩種，這里以稀釋法為例。按照常規(guī)稀釋法接種受試菌。經(jīng)35孵育1620h。結果判斷：大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌MIC：頭孢泊肟4g/ml、頭孢他啶1g/ml、氨曲南1g/ml、頭孢噻肟1g/ml、頭孢曲松1g/ml，任何一種藥物達到上述標

3、準，提示該菌株可能產(chǎn)ESBLs。奇異變形桿菌MIC：頭孢泊肟1g/ml、頭孢他啶1g/ml、頭孢噻肟1g/ml，任何一種藥物達到上述標準，提示該菌株可能產(chǎn)ESBLs。（使用一種以上的藥物進行篩選，將會提高檢測的敏感性）。（2）、雙紙片協(xié)同試驗：按常規(guī)紙片擴散法在MH 平板上涂布受試菌，平板中心貼阿莫西林/克拉維酸紙片。在該紙片的周圍，按紙片中心距25mm處分別貼上頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢泊肟以及氨曲南等抗生素紙片。35培養(yǎng)1820h后閱讀結果。任何一種紙片與阿莫西林/克拉維酸紙片質檢產(chǎn)生“坑”或“匙扣”現(xiàn)象者，提示該菌株可能產(chǎn)ESBLs。（3）、酶抑制劑增強確證試驗：確證試驗有紙片法

4、和稀釋法兩種，這里以稀釋法為例。接種方法同初篩試驗。經(jīng)35孵育1620h。頭孢他啶：0.25128g/ml；頭孢他啶/克拉維酸：0.25/4128/4g/ml 和頭孢噻肟：0.2564g/ml；頭孢噻肟/克拉維酸0.25/464/4g/ml。與克拉維酸聯(lián)合的藥物MIC相對單獨藥物MIC3個倍比稀釋度，即判定該菌株產(chǎn)ESBLs。2010年1月，美國臨床與實驗室標準化研究所（CLSI）首次公布了修訂的頭孢菌素(頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟和頭孢曲松)和氨曲南的解釋標準（CLSI M100-S20）。并且頭孢唑林解釋標準于2010年6月被再次修訂。當使用新修訂的解釋標準時，在報告結果前不再

5、需要常規(guī)測試ESBLs（即，不再需要將頭孢菌素類、氨曲南或青霉素類結果從敏感修正為耐藥）。然而，為了流行病學調查或者感染控制目的，仍可測試ESBLs。3. 碳青霉烯酶的檢測：碳青霉烯酶是指能夠水解碳青霉烯類抗菌藥物如亞胺培南和美羅培南等的一類內酰胺酶。2010年6月，美國臨床與實驗室標準化研究所（CLSI）修改了碳青霉烯類對腸桿菌的藥敏折點（CLSI M100-S20-U ），使用新的折點后，碳青霉烯的檢測可以不作為常規(guī)藥敏試驗的報告內容。然而，為了流行病學調查或者感染控制目的，仍可檢測碳青霉烯酶，碳青霉烯酶陽性結果不需要對藥敏結果進行修改。這里主要介紹使用改良霍奇試驗（MHT）的方法檢測碳青

6、霉烯酶。操作步驟如下：接種物：使用肉湯或生理鹽水制備0.5麥氏標準的大腸埃希菌ATCC 25922菌懸液（指示菌），并做1:10稀釋。按常規(guī)紙片擴散法程序，將菌液涂布在MH平板上，干燥310min.將10g厄他培南紙片或10g美羅培南紙片貼在平皿中心。接種：使用10l接種環(huán)或棉拭子，挑取35個在血平板上過夜培養(yǎng)的受試菌，沿紙片邊緣向平皿邊緣劃直線接種，接種長度至少達到2025mm。35孵育1620h。如下圖所示：大腸埃希菌ATCC 25922大腸埃希菌ATCC 25922被厄他培南所抑制形成的抑菌圈大腸埃希菌ATCC 25922增強生長。受試菌產(chǎn)生碳青霉烯酶，使擴散到培養(yǎng)基中的厄他培南失活。因

7、此，該處無足夠量的厄他培南抑制大腸埃希菌ATCC 25922生長，出現(xiàn)抑菌圈凹進現(xiàn)象。（1） 受試菌株，碳青霉烯酶陽性。（2） 受試菌株，碳青霉烯酶陰性。（3）受試菌株，碳青霉烯酶陽性。注意：（1）、某些試驗菌株可產(chǎn)生抑制ATCC 25922生長的物質。當出現(xiàn)此種情況時，在劃線兩側可見清晰的抑制生長區(qū)（如下圖），對于這樣的菌株，MHT不能解釋。 （2）還沒有關于該項試驗用于檢測非發(fā)酵革蘭陰性桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶的資料。二、 耐甲氧西林葡萄球菌的檢測耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）是醫(yī)院感染的主要致病菌之一。開展對MRS的篩選，對于控制醫(yī)院感染的流行，減少多重耐藥菌株的產(chǎn)生與傳播都有重要意義。MRS菌株

8、的表型檢測方法主要有紙片擴散法、稀釋法和苯唑西林鹽平板篩選試驗。這里主要介紹稀釋法。金黃色葡萄球菌和路登葡萄球菌：按照常規(guī)稀釋法接種受試菌， 35孵育1620h。苯唑西林MIC4g/ml；頭孢西丁MIC8g/ml。苯唑西林和頭孢西丁，兩種藥物中有任一結果達到上述標準，也即任一結果為耐藥，則應報告受試菌株對苯唑西林耐藥。除路登葡萄球菌外的凝固酶陰性葡萄球菌：按照常規(guī)稀釋法接種受試菌， 35孵育1620h。當苯唑西林MIC0.5g/ml，即應報告受試菌株對苯唑西林耐藥。耐甲氧西林的葡萄球菌，對所有的青霉素類、-內酰胺/-內酰胺酶抑制劑復合物、頭孢類（具有抗MRSA活性的頭孢菌素除外）和碳青霉烯類抗

9、生素耐藥。三、 萬古霉素中介（VISA）和耐藥（VRSA）金黃色葡萄球菌的檢測 測定所有葡萄球菌分離株對萬古霉素敏感性應采用MIC試驗。紙片擴散法既不能區(qū)分萬古霉素敏感與中介金黃色葡萄球菌，也不能區(qū)分萬古霉素敏感、中介和耐藥凝固酶陰性葡萄球菌，任何萬古霉素抑菌圈直徑7mm葡萄球菌均不能報告該菌株對萬古霉素敏感，必須通過萬古霉素MIC測定進行確認。萬古霉素瓊脂稀釋篩選法：接種物：將受試菌株制備成0.5麥氏濁度；接種：吸取10l菌懸液點種于含6g/ml萬古霉素的腦心浸液瓊脂平板（BHI）上，或者用棉拭子蘸取菌懸液，擠去多余菌液，在平板上涂成直徑1015mm斑點或者在部分區(qū)域劃線接種；結果：經(jīng)過35

10、孵育24h，透射光下仔細觀察細菌生長情況，1個菌落或存在淡的膜狀生長，提示該受試菌對萬古霉素的敏感性降低。注意：在此篩選平板上生長的金黃色葡萄球菌，必須進一步采用稀釋法測定萬古霉素MIC值，以確認中介或耐藥。四、 高水平氨基糖苷類耐藥腸球菌（HLARE）檢測高水平氨基糖苷類篩選試驗，能夠預測對于嚴重的腸球菌感染（如心內膜炎）情況下，氨芐西林、青霉素或者萬古霉素與一種氨基糖苷類類抗生素聯(lián)合治療時的協(xié)同效應，除非證明受試菌株對慶大霉素或鏈霉素高水平耐藥之外，上述藥物聯(lián)合對腸球菌可起到協(xié)同殺菌效果。因此測定對氨基糖苷類高劑量藥物的敏感性對臨床治療具有重要的意義。檢測方法：1、紙片擴散法：接種：按標準

11、紙片擴散法操作，將0.5麥氏單位的受試菌菌懸液均勻涂布于MH平板上，將 120g慶大霉素紙片或300g鏈霉素紙片貼于平板上；結果：經(jīng)35孵育1618h后查看抑菌圈直徑，6mm=耐藥；79mm=不確定；10mm=敏感。2、肉湯微量稀釋法：按照常規(guī)稀釋法接種受試菌，35培養(yǎng)。慶大霉素,孵育24h，MIC500g/ml為耐藥，500g/ml為敏感；鏈霉素，孵育2448h(假如在24h敏感，繼續(xù)孵育)，MIC1000g/ml為耐藥，1000g/ml為敏感3、標準解讀：耐藥與作用于細胞壁合成的藥物（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素）聯(lián)合無協(xié)同作用；不確定需要采用瓊脂稀釋法或肉湯稀釋法進行確證；敏感與作用于細

12、胞壁合成、而且也是敏感的藥物（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素）聯(lián)合出現(xiàn)協(xié)同作用。五、 萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）檢測由VRE所引起的感染治療十分棘手，而且還存在將萬古霉素耐藥性傳到毒力更強的細菌如金黃色葡萄球菌的危險，因此臨床實驗室對VRE菌株的檢測具有非常重要的意義。對VRE的檢測方法同對VISA和VRSA的檢測方法。六、 誘導克林霉素耐藥檢測 MLS群抗菌藥物包括大環(huán)內酯類（如紅霉素、阿奇霉素）、林可霉素類(如克林霉素)和鏈陽菌素類（如奎奴普丁/達福普丁），是三類功能密切相關但結構不同的抗生素。葡萄球菌對大環(huán)內酯類的耐藥機制主要有兩種，一是MS表型：對大環(huán)內酯類和B型鏈陽菌素耐藥，但不耐克林霉素，即紅霉素耐藥而克林霉素敏感。二是B型鏈陽菌素固有表型：由erm基因決定。如果erm基因穩(wěn)定表達，則表現(xiàn)對紅霉素、克林霉素和其它MLS成員均耐藥。但在某些情況下，erm基因需要誘導劑才能表達對克林霉素耐藥，否則體外實驗可能會表現(xiàn)為對克林霉素敏感，而紅霉素可以作為這種誘導劑?？肆置顾卣T導耐藥的檢測方法包括D試驗法和肉湯微量稀釋法。1、 D試驗法按標準的紙片擴散法進行操作，涂布0.5麥氏單位受試菌菌懸液于MH瓊脂平板上，將紅霉素（15g）與克林霉素（2g）紙片相鄰放置，邊緣相距1526mm。35孵育1618h后