超敏乙肝詳解

1、項目編號 上海市醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用能力技術(shù)審核申請書技術(shù)名稱： 高靈敏度HBV DNA病毒載量檢測（PCR法） 申請單位： 上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院 主管部門： 上海市普陀區(qū)衛(wèi)生局 申請時間： 2015 年 1 月 9 日 上海市醫(yī)學(xué)會二0 年 月申請須知一、本申請表的內(nèi)容均為真實信息；二、嚴(yán)格按照醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法的有關(guān)規(guī)定，建立和完善技術(shù)應(yīng)用的規(guī)章制度和操作規(guī)范，確保醫(yī)療安全；三、注意病例資料的整理和分析，及時總結(jié)臨床應(yīng)用信息，按期接受評估；四、如應(yīng)用期間發(fā)生醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法第四十一條所規(guī)定情形的，立即暫停臨床應(yīng)用并上報市衛(wèi)生局；五、如應(yīng)用期間發(fā)生醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法第四十四條

2、所規(guī)定情形的，報請市衛(wèi)生局決定是否需要重新進行醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用能力技術(shù)審核。 六、申請的醫(yī)療技術(shù)距上次同一醫(yī)療技術(shù)未通過臨床應(yīng)用能力技術(shù)審核時間未滿12個月的不得申請。 項目負(fù)責(zé)人閱知并簽章 日期 填表說明 一、本市轄區(qū)內(nèi)凡申請醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用的醫(yī)療機構(gòu)，均應(yīng)填報本表。二、申請書各項內(nèi)容，必須實事求是，內(nèi)容真實，表達要明確、嚴(yán)謹(jǐn)，字跡要清晰易辨。三、所有填寫入表格的技術(shù)人員必須是取得執(zhí)業(yè)資格，經(jīng)衛(wèi)生行政部門注冊在本單位的在編或正式聘用人員。四、本申請書一式八份，用A4紙打印。五、電子版申請書一份（刻錄成光盤）。六、本申請書應(yīng)附如下資料：1. 醫(yī)療機構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證副本及其復(fù)印件（加蓋單位公章）2.

3、 醫(yī)療機構(gòu)醫(yī)學(xué)倫理審查報告（附：倫理委員會成員姓名、專業(yè)、職務(wù)、職稱等情況）3. 該技術(shù)的相關(guān)管理制度和風(fēng)險防范預(yù)案4. 與本項目相關(guān)的醫(yī)療器械或藥品注冊證書、經(jīng)營廠商營業(yè)執(zhí)照及經(jīng)營許可證復(fù)印件（加蓋公司及醫(yī)療機構(gòu)公章）5. 國內(nèi)外有關(guān)該項技術(shù)研究和使用情況的檢索報告及技術(shù)資料6. 衛(wèi)生行政部門要求的其他相關(guān)文件。 七、項目編號由上海市醫(yī)學(xué)會填寫。一、醫(yī)療機構(gòu)基本情況名稱上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院性質(zhì)綜合性醫(yī)院 ?？漆t(yī)院 其它：醫(yī)院等級三 級 乙 等 其它：總占地面積27163平方米床位數(shù)1000 張在編人員1352人單位地址上海市蘭溪路164號郵政編碼200062醫(yī)療機構(gòu)主管部門普陀區(qū)衛(wèi)生局醫(yī)療機

4、構(gòu)聯(lián)系人聯(lián)系電話（手機）項目聯(lián)系人康向東聯(lián)系電話（手機）電子郵箱傳真相應(yīng)診療科目登記情況HBV DNA 定量檢測相應(yīng)科室設(shè)置情況檢驗科分為：生化室、免疫室、細(xì)菌室、分子生物學(xué)室、臨檢室（門診、急診）二、申請單位相關(guān)學(xué)科基本情況（一）項目負(fù)責(zé)人姓 名康向東性 別男出生年月1959.2所在科室檢驗科執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格證書編號畢業(yè)學(xué)校上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué) 歷博士學(xué) 位博士專 業(yè)檢驗專 長腫瘤免疫工作年限29相應(yīng)技術(shù)工作年限12職 稱主任技師獲得職稱時間20041.何時何地開始從事本項目的專業(yè)工作2003年上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院檢驗科2.本項目專業(yè)培訓(xùn)（進修）情況時間地點指導(dǎo)醫(yī)師操作例數(shù)參與例數(shù)其他需說明情況

5、個人專業(yè)工作簡述含主要科技成就：康向東，男，主任技師，醫(yī)學(xué)（內(nèi)科學(xué)）博士學(xué)位，碩士生導(dǎo)師。現(xiàn)任上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院檢驗科主任兼實驗中心副主任，上海市核學(xué)會理事，上海醫(yī)學(xué)會檢驗分會委員、上海市免疫學(xué)會第十屆理事會免疫技術(shù)專業(yè)委員會委員，上海市科委2011年度“科技創(chuàng)新行動計劃”生物醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)學(xué)研醫(yī)合作項目專家委員會委員，檢驗醫(yī)學(xué)編委會委員。已在美國國立生物技術(shù)信息中心GenBank 數(shù)據(jù)庫注冊7條新基因。主要從事自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)病機理、診斷及實驗治療的研究，在腫瘤標(biāo)志物的篩選、抗腫瘤抗體的制備上已取得初步研究成果。曾今主持完成了國家自然科學(xué)基金項目、衛(wèi)生部科學(xué)研究課題，上海市科委重

6、點項目等多項課題研究，目前在研課題為上海市科委課題。長期從事分子生物學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究。近期發(fā)表論著30余篇，SCI論文4篇。擔(dān)任系統(tǒng)性紅斑狼瘡及實用風(fēng)濕病學(xué)等書的編委。帶教碩士研究生5名，主要研究方向為中藥在腫瘤治療中的作用機制研究，其中一篇獲得上海市中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀畢業(yè)論文二等獎。其 他近三年內(nèi)是否發(fā)生與同類技術(shù)有關(guān)的醫(yī)療事故：是（ ）否（ ）（二）學(xué)科人員學(xué)歷結(jié)構(gòu)總計人數(shù)博士碩士本科專科及以下30120人員情況姓名性別年齡學(xué)歷職稱專業(yè)從事本專業(yè)年限康向東男56博士教授免疫學(xué)12吳蓉女45本科主任技師微生物學(xué)23鄭瑾女42本科副主任技師 免疫學(xué)20相芬芬女28碩士技師分子生物學(xué)3（三

7、）項目所在科室的專用設(shè)備、設(shè)施及工作基礎(chǔ)場所情況獨立病區(qū) 個獨立病床 張其他場所情況（包括專用實驗室等）場所名稱面積（平方米）上海臨床檢驗中心批準(zhǔn)的臨床基因擴增檢測實驗室120專用設(shè)備情況設(shè)備名稱型號及產(chǎn)地臺 數(shù)必備設(shè)備全自動核酸檢測工作站QIAsymphony RGQ，德國1套應(yīng)有設(shè)備采血管離心機目前已開展同類技術(shù)應(yīng)用情況已開展項目（具體名稱）開展時間（年）工作量（例/年）手術(shù)成功率（%）生存率（%）HBV DNA12000三、開展該項技術(shù)的目的、意義和實施方案（一）目的和意義（需包括醫(yī)院的總體業(yè)務(wù)量與此項技術(shù)相關(guān)醫(yī)療需求等）： 1、實施項目的意義：（1）項目背景及意義中國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，

8、根據(jù)衛(wèi)生部2002年統(tǒng)計資料顯示，我國乙型肝炎的現(xiàn)患率為277/萬，是美國的40多倍（年發(fā)病率為95/萬）。流行病學(xué)調(diào)查表明，我國至少有8億人感染過乙型肝炎，人群中的乙肝表面抗原的攜帶率高達10.34%，即約有1.3億人為乙肝病毒攜帶者，幾乎占全世界總數(shù)的一半，這些乙肝病毒攜帶者中的四分之一最終將發(fā)展成慢性肝炎、肝硬化或原發(fā)性肝癌。全國1200多萬的慢性肝炎病人中，每年死亡人數(shù)達30萬之多，其中約半數(shù)為肝癌。在傳統(tǒng)的慢性乙型肝炎治療中，通常以HBV DNA <2,000 IU/ml作為治療結(jié)束的標(biāo)準(zhǔn)之一，在停藥以后，往往會出現(xiàn)病毒反跳的狀況，并沒有真正達到預(yù)期治療的效果，同時也容易導(dǎo)致病

9、毒變異和耐藥的發(fā)生。由于受常規(guī)的HBV DNA檢測靈敏度所限，無法真正反應(yīng)治療終點病人的狀況。慢性乙型肝炎的治療急需要一個更靈敏的病毒載量檢測方法，用于確定治療的終點，最大程度降低治療后病毒反跳以及發(fā)生變異耐藥的可能。（2）項目需求A. 臨床需求：a) 高靈敏度HBV DNA定量檢測對抗病毒治療的預(yù)后監(jiān)測：2001-2005年，不斷有學(xué)者在肝病專業(yè)雜志中發(fā)表文章，指出慢性乙肝藥物治療過程中，HBV DNA濃度越低，藥物更容易應(yīng)答，治療效果越好，耐藥率亦更低。*Lai CL, et al. Hepatology 2005; 42(suppl 1):232A233A (Abstract 92)作者

10、將HBeAg(+)、經(jīng)LdT或LVD治療24周時不同HBV DNA水平的患者在52周時做了四項評估，從上圖可以看出：病毒濃度：24周時HBV DNA濃度<300copies/ml時，在52周時有91%的病人仍然維持在<300copies/ml，但是隨著濃度區(qū)間的升高，在52周HBV DNA濃度能夠下降到300copies/ml的病人比例卻逐漸減少，尤其24周濃度高于104copies/ml的病人只有6%能夠下降至300copies/ml以下；HBeAg轉(zhuǎn)換：情況與24周時HBV DNA的濃度有顯著相關(guān)性，濃度越低，轉(zhuǎn)陰比例越高。<300copies/ml時，有約47%病人HB

11、eAg轉(zhuǎn)陰，濃度>104copies/ml時，只有約5%病人的HBeAg轉(zhuǎn)陰；ALT復(fù)常：24周時濃度越高，ALT復(fù)常率越低；病毒反彈：24周時病毒濃度低于300copies/ml的病人只有1%發(fā)生反跳，隨著濃度區(qū)間的上升，反跳率逐漸升高，當(dāng)濃度>104copies/ml時，反彈率達到14%。綜合以上數(shù)據(jù)，可以看出，治療24周時，如果病毒載量越低（<300copies/ml），病人的抗病毒治療預(yù)后效果越好。b) 高靈敏度HBV DNA定量檢測在抗病毒治療過程中對耐藥突變的預(yù)防：在慢性乙肝治療過程中最大的難題是耐藥的產(chǎn)生，而與治療耐藥相比，預(yù)防耐藥則顯得尤為重要?？焖僖种撇《緩?fù)

12、制至不可測水平，會有效降低耐藥的發(fā)生。*Yuen MF,et al. Hepatology 2001;34(4):785-791*Locarnini S, et al. J Hepatol 2005; 42(Suppl 2):17 (Abstract 36)研究對24周病毒載量不同濃度分布的HBeAg陽性病人進行跟蹤，發(fā)現(xiàn)在第29個月時，濃度低于檢出限（<200copies/ml）的病人耐藥發(fā)生率只有8%，而濃度高于104copies/ml的病人發(fā)生耐藥的機率高達64%。研究同時對48周病毒載量1000copies/ml分界的HBeAg陰性病人隨訪，發(fā)現(xiàn)在144周時耐藥率分別為6%（&l

13、t;1000copies/ml）和49%(>1000copies/ml）。結(jié)果表明，抗病毒治療后病人體內(nèi)病毒濃度越低，發(fā)生耐藥的機率越低。c) 高靈敏度HBV DNA定量檢測對肝硬化及肝癌的風(fēng)險評估： 2006年，一項前瞻性研究，跟蹤調(diào)查了臺灣地區(qū)從1991年到2004年，大約3600名HBsAg-positive的乙肝感染者，分析了HBV DNA，HBeAg， ALT等一系列指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)HBV DNA的水平與肝硬化和肝癌發(fā)生的風(fēng)險顯著相關(guān)，是最具有價值的指標(biāo)，且HBV DNA水平越低，則肝硬化和肝癌風(fēng)險越低。HBV DNA 基線（copies/ml）肝硬化相對風(fēng)險值（n=3582)肝癌相

14、對風(fēng)險值（n=3653）<3001.01.0300-9.9 x 1031.4 (0.9-2.2)1.1 (0.5-2.3)1.0-9.9 x 1042.5 (1.6-3.8)2.3 (1.1-4.9)1.0-9.9 x 1055.6 (3.7-8.5)6.6 (3.3-13.1)1.0 x 1066.5 (4.1-10.2)6.1 (2.9-12.7)1. IIoeje UH et al. Gastroenterology. 2006;130:678686.2. Chen CJ et al. JAMA. 2006;295:6573.d) 高靈敏度HBV DNA定量檢測對抗病毒治療終點的確

15、認(rèn)：2007年由美國斯坦福大學(xué)和全球多個醫(yī)學(xué)院和肝病研究中心共同制訂了“核苷類藥物治療慢性乙型肝炎路線圖”，發(fā)表在臨床腸胃及肝臟病學(xué)雜志，強調(diào)了：l 定期檢測血清HBV DNA是評價治療療效的基礎(chǔ)l 定義了不同治療應(yīng)答和監(jiān)測時間點（完全應(yīng)答為HBVDNA檢測為陰性(<60IU/ml)）l 高靈敏HBV DNA定量檢測試劑對于治療評估具有重要的臨床價值B. 指南的更新：隨著國際上慢性乙型肝炎（CHB）治療手段和檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，以及相關(guān)臨床研究的不斷深入，高敏的HBV DNA定量檢測在治療預(yù)后和藥物療效評價方面的臨床價值被越來越多的臨床醫(yī)生所重視，并被相繼寫入了美國和歐盟的慢性乙型肝炎治

16、療的指南，用于指導(dǎo)個體化的治療方案。在國內(nèi)，越來越多的臨床醫(yī)生也開始重視高敏HBV病毒載量檢測的臨床價值。以上關(guān)于慢性乙肝治療指南中均指出：治療慢性乙肝的目標(biāo)是持續(xù)性抑制HBV病毒的復(fù)制，直至HBV DNA水平減少到未檢出（高敏熒光定量PCR法）。2、醫(yī)院現(xiàn)有總體業(yè)務(wù)量目前我院常規(guī)乙肝DNA檢測每月有800例，其中低于檢測水平（500IU/ml）即當(dāng)前意義的“陰性”樣本約占整體樣本的2030%左右，這部份樣本都需要通過更高敏感性的檢測試劑進行測定，以幫助判定這些樣本中有多少可以滿足臨床指南要求。2012年6月份的中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) YY-T 1182-2010 核酸擴增檢測用試劑盒規(guī)定

17、了需要使用全程參與的內(nèi)標(biāo)、對核酸進行提取和純化、要求加樣體積不少于20ul/反應(yīng)體積不低于40ul的要求。2013年5月發(fā)布的乙肝定量檢測試劑注冊指導(dǎo)原則也明確了高靈敏HBV DNA檢測試劑的檢測下限不得高于30IU/ml。這些要求的提出將高靈敏度HBV檢測的平臺提升到一個前所未有的水平。由于新行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提出HBV DNA核酸需要經(jīng)過提取和純化才能夠被使用，且檢測下限不能高于30IU/ml ，這意味著傳統(tǒng)的煮沸方法已不再適用。目前核酸純化的方法主要有硅膠膜柱提取法和磁珠吸附法，這兩種方法相比較煮沸法而言，操作步驟更為復(fù)雜，一方面增加了人工操作的難度，耗時較長，另一方面也容易出錯并導(dǎo)致污染的機率增

18、加，考慮到報告的及時性和結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性，需要采用全自動方案來進行高靈敏度乙肝病毒的檢測。（二）實施方案：1、從臨床應(yīng)用的角度而言，綜合2007年由美國斯坦福大學(xué)和全球多個醫(yī)學(xué)院和肝病研究中心共同制訂了“核苷類藥物治療慢性乙型肝炎路線圖”，2009年美國肝病研究學(xué)會（AASLD），2012年亞太地區(qū)肝病研究協(xié)會（APASL），2012年歐洲肝病學(xué)會（EASL）發(fā)布的慢性乙肝治療指南，我室計劃在以下幾個節(jié)點對病人實施高靈敏度HBV DNA定量檢測：l 抗病毒治療第24周，用于判定治療的應(yīng)答情況及后續(xù)處理方案。l 對常規(guī)HBV DNA檢測結(jié)果為“小于檢出限”的樣本進行復(fù)測，用于對病人樣本進行精

19、確定量，幫助對后續(xù)的HBeAg轉(zhuǎn)換、病毒耐藥、ALT復(fù)常進行預(yù)后。l 對治療結(jié)束后的病人進行動態(tài)監(jiān)測，提前預(yù)警病毒的反跳。2、從操作層面來看，以目前的標(biāo)本量情況，每周開展12次檢測，每次檢測時，直接將病人的原始采血管離心后推送到全自動核酸提取工作站上，機器會自動進行核酸的提取及體系構(gòu)建，隨后人工把反應(yīng)管安放到熒光定量PCR儀中進行檢測。每次檢測都需要帶上陰性對照品、弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品、強陽性室內(nèi)質(zhì)控品、四個定標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品，所有這些樣品都需要經(jīng)歷與臨床標(biāo)本一致的提取和檢測過程。四、該項醫(yī)療技術(shù)的基本概況（衛(wèi)生行政部門公布的技術(shù)目錄內(nèi)的技術(shù)除外）（一）技術(shù)路線（包括技術(shù)方法、所采用的儀器設(shè)備及技術(shù)的科

20、學(xué)性等）：1技術(shù)方法： 本項目采用磁珠法核酸純化技術(shù)、PCR熒光探針法、內(nèi)標(biāo)技術(shù)，用于對臨床血清和血漿中乙型肝炎病毒核酸（DNA）的定量檢測。其中核酸提取采用磁珠法核酸純化技術(shù)實現(xiàn)病毒核酸的提取及純化。樣本中加入蛋白酶使病毒裂解并將病毒DNA釋放出來，磁珠表面包裹有一層二氧化硅，二氧化硅在高離液鹽條件下特異性吸附核酸DNA，接著通過洗滌步驟有效去除二價陽離子和蛋白質(zhì)等PCR反應(yīng)抑制物，最后用洗脫液（低鹽）將病毒DNA從磁珠上洗脫下來，完成純化。經(jīng)過純化的病毒DNA不含蛋白質(zhì)、核酸酶和其他雜質(zhì)。檢測分析采用臨床上應(yīng)用最為成熟的熒光定量PCR法。通過PCR反應(yīng)擴增HBV基因組目的片段，擴增反應(yīng)同時

21、將特異性熒光探針?biāo)舛尫虐l(fā)光基團，通過檢測及分析自由發(fā)光基團受激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號可實現(xiàn)對HBV病毒DNA的定量檢測。操作過程中，將內(nèi)對照參入到每個樣本中，通過內(nèi)對照對整個工作流程進行監(jiān)控，包括病毒核酸純化步驟、PCR反應(yīng)體系構(gòu)建步驟、核酸擴增與檢測步驟等，可有效防止產(chǎn)生假陰性檢測結(jié)果。2設(shè)備：QIAsymphony SP/AS全自動樣本處理工作站：可實現(xiàn)全自動病毒核酸純化、PCR反應(yīng)液配制及上樣Rotor-Gene Q熒光定量PCR儀：實現(xiàn)PCR擴增3先進性、科學(xué)性： l 自動化實現(xiàn)核酸提取和PCR反應(yīng)體系構(gòu)建，減少人為誤差，提高核酸純度l 標(biāo)準(zhǔn)化的工作流程，消除了檢測平臺差異導(dǎo)致的結(jié)果偏差

22、l 提供從樣本到結(jié)果完整解決方案，實驗結(jié)果實現(xiàn)可靠溯源l 原始樣品管直接上機，節(jié)省時間l 預(yù)裝試劑盒，減少人為操作，防止交叉污染l 最低檢出限：20IU/ml，符合新的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)l 試劑盒配備內(nèi)標(biāo)，全程監(jiān)控核酸純化、擴增及檢測，可有效防止假陰性4性能指標(biāo)：l 適用樣本類型：血清、血漿l 上樣量： 200ull 最低檢測限：20IU/mll 線性范圍：40-1.1E8 IU/mll 可檢測基因型：A-H，8個基因型l 精密度CV：<5%l 適用平臺：QIAsymphony RGQl 通量：一次運行72份檢測，7小時完成144份檢測結(jié)果（二）該項技術(shù)的國內(nèi)外應(yīng)用情況（包括該項技術(shù)在國內(nèi)外的應(yīng)用

23、時間、范圍、例數(shù)及獲得相關(guān)監(jiān)督管理部門的準(zhǔn)入情況）l 臨床基因擴增檢驗技術(shù)早在2009年已被衛(wèi)生部列為醫(yī)療二類技術(shù)目錄中，因此在中國應(yīng)用已非常成熟。l 超敏乙肝檢測的項目，早在2007年由美國斯坦福大學(xué)和全球多個醫(yī)學(xué)院和肝病研究中心共同制訂了“核苷類藥物治療慢性乙型肝炎路線圖”后各大指南就已經(jīng)要求乙肝檢測限需實現(xiàn)高精度，如2009年美國肝病學(xué)會就指出：清除HBV的診斷標(biāo)準(zhǔn)其中之一，是采用敏感的PCR試劑，HBV DNA未檢出；l 中國在2013年國家衛(wèi)生計生委關(guān)于印發(fā)醫(yī)療機構(gòu)臨床檢驗項目目錄中，就將高敏度乙型肝炎病毒DNA定量檢測列入了該目錄中。（三）適應(yīng)癥： 1. 慢性乙型肝炎抗病毒治療第2

24、4周病毒學(xué)完全應(yīng)答狀態(tài)（HBV-DNA<60 IU/ml）的確定：以評估抗病毒藥物的療效和選擇正確的后續(xù)治療方案。2. 慢性乙型肝炎抗病毒治療的終點判定：依據(jù)HBV-DNA定量結(jié)果不可測（高敏PCR方法) 來判定患者停止治療。3. 慢性乙型肝炎抗病毒治療的預(yù)后：對常規(guī)HBV DNA檢測結(jié)果為“小于檢出限”的樣本進行復(fù)測，用于對病人樣本進行精確定量，幫助對后續(xù)的HBeAg轉(zhuǎn)換、病毒耐藥、ALT復(fù)常進行預(yù)后。4. 慢性乙型治療結(jié)束后期的動態(tài)監(jiān)測：及時發(fā)現(xiàn)低水平HBV DNA病毒的突破和反彈。現(xiàn)有國內(nèi)傳統(tǒng)乙肝DNA檢測的試劑盒最低只能檢測至500-1000IU/ml，無法真正確定治療治療第6個

25、月病毒學(xué)完全應(yīng)答狀態(tài)（HBV-DNA<60 IU/ml）和準(zhǔn)確判定治療終點和停藥時機，從而使患者耐藥及復(fù)發(fā)的風(fēng)險增加。用該方法監(jiān)測乙肝DNA濃度在1000IU/ml以下的病人用藥后的療效評估，確定慢性乙肝治療達到真正終點。（四）禁忌癥：無（五）不良反應(yīng)：無（六）該項技術(shù)的療效判定標(biāo)準(zhǔn)及評估方法：1判定標(biāo)準(zhǔn)： 1）內(nèi)標(biāo)：從提取開始向每個樣本中加入大自然中不存在的、與HBV DNA目標(biāo)序列相近似的一段基因序列，競爭性的參與核酸提取、純化、加樣和擴增的整個過程，監(jiān)測并防止擴增結(jié)果假陰性的發(fā)生。2）室內(nèi)質(zhì)控：每次實驗中加入相同批次的陰性對照、弱陽性質(zhì)控、強陽性質(zhì)控，三個質(zhì)控品結(jié)果均需要符合質(zhì)控體

26、系結(jié)果要求。當(dāng)其中某一個結(jié)果不符合時，需要暫停發(fā)放報告，并對實驗體系進行檢查與確認(rèn)，解決問題后重新檢測。3）室間質(zhì)評：每年參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心或者上海市臨床檢驗中心組織的兩次室間質(zhì)評，結(jié)果達標(biāo)2評估方法：參考上海市臨床檢驗中心的新項目申請要求，驗證包括：正確度、靈敏度、批內(nèi)精密度、批間精密度、檢測下限、線性范圍等。1) 精密度： a) 實驗方案：批內(nèi)和批間精密度：取兩個臨床樣本（5次方與3次方），實驗前確認(rèn)儀器運轉(zhuǎn)正常，質(zhì)控在控。批內(nèi)精密度為一天內(nèi)在儀器上重復(fù)檢測20次；批間精密度為每次在儀器上檢測5次，4個工作日完成，上述實驗均保留原始數(shù)據(jù)，并計算SD和CV值。b) 結(jié)果判斷：批內(nèi)精密度1

27、0%，批間精密度CV值15%，則認(rèn)為該項目達到檢測要求。2) 正確度（三選一）a) 方法學(xué)比對實驗方案：取20份其他醫(yī)院檢測過的樣本，重新提取檢測，將檢測結(jié)果與其他醫(yī)院的數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果判斷：如果兩樣本檢測結(jié)果對數(shù)值的差異在一個LOG值范圍內(nèi)，80%的樣本符合則認(rèn)為該項目正確度符合要求。b) 對已知靶值物質(zhì)的檢測（室間質(zhì)評樣本）實驗方案：以最近兩次參加衛(wèi)生部臨檢中心或上海市臨檢中心EQA室間質(zhì)量回報的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對回饋的報告進行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析。結(jié)果判斷：計算上報的數(shù)據(jù)與靶值的偏倚，在規(guī)定的范圍內(nèi)；如果衛(wèi)生部或上海臨檢中心回饋的報告顯示相應(yīng)項目狀態(tài)為通過，則認(rèn)為該項目正確度符合要求。c) 對標(biāo)

28、準(zhǔn)物質(zhì)進行檢測（國際標(biāo)準(zhǔn)品或國家標(biāo)準(zhǔn)品）實驗方案：對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行提取檢測，將檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的靶值范圍進行比較。結(jié)果判斷：檢測結(jié)果在靶值的規(guī)定范圍內(nèi)，則認(rèn)為該項目正確度符合要求。3) 線性范圍（可報告范圍）驗證： 實驗方案：Ø 樣本的選擇：病人樣本。Ø 系列濃度樣本：將高濃度（7次方）的樣本按照1:10倍比稀釋連續(xù)7個濃度（采用陰性血清稀釋至6次方、5次方、4次方、3次方、100IU、40IU、20IU）每個水平重復(fù)測定3次。Ø 樣本保存條件：-20。Ø 實驗前確認(rèn)儀器運轉(zhuǎn)正常，質(zhì)控在控，保留原始數(shù)據(jù)。結(jié)果判斷：取三次檢測結(jié)果的平均值進行相關(guān)性分析，相

29、關(guān)性R20.98則認(rèn)為線性通過驗證。4) 最低檢出限（靈敏度）驗證：實驗方案：取一濃度為1-5×103IU/ml的樣本，將樣本稀釋到20，40IU/ml（采用陰性血清稀釋），分別檢測10次，10次都能檢出的最小濃度為該項目的最低檢出限。（七）與同種疾病的其他診療技術(shù)的風(fēng)險、療效、費用及療程比較： 當(dāng)前高靈敏度HBV DNA檢測項目與常規(guī)的乙肝DNA定量檢測相比較如下：1、 風(fēng)險：高靈敏度HBV DNA檢測項目相比于常規(guī)HBV DNA檢測項目而言，增加了核酸提取與純化的步驟、增加了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品、提高了自動化程度，在控制假陰性、人為誤差和實驗室污染等方面具有更好的風(fēng)險防范措施；2、 療效與

30、療程：常規(guī)HBV DNA檢測的主要用途在于對抗病毒治療前期病人體內(nèi)血液中HBV DNA濃度進行測定，并在后續(xù)的第12周進行動態(tài)跟蹤。在第24周的病毒監(jiān)測中由于其靈敏度只能達到5001000IU/ml，無法正確給出是否達到治療終點（<60IU/ml）的評價。對于后續(xù)的預(yù)后，包括HBV DNA濃度的反跳、HBeAg轉(zhuǎn)陰、ALT復(fù)常、病毒耐藥預(yù)測、肝硬化及肝癌的風(fēng)險預(yù)測都無法給出正確的評價。高靈敏度HBV DNA檢測突破了常規(guī)HBV DNA檢測的極限，可以有效判斷抗病毒治療終點并對病人的療效和預(yù)后給出有效評估。3、 費用：目前常規(guī)HBV DNA定量檢測的上海收費為80元。相比于常規(guī)HBV DNA檢測試劑盒，高靈敏度HBV DNA檢測試劑盒在技術(shù)上有了突破性的改進，加上自動化程度的提高，導(dǎo)致試劑檢測成本顯著高于常規(guī)HBV DNA檢測。兩者的技術(shù)比較見下表。目前我室僅將高靈敏度HBV DNA